采用SELEX技術(shù)篩選脫氧雪腐鐮刀菌烯醇適配子的初步研究.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是由鐮刀菌的某些種產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性相似的有毒代謝產(chǎn)物——單端孢霉烯族化合物中的一種，主要污染小麥、玉米等谷物及其制品，溫帶地區(qū)的谷物污染嚴(yán)重，在收割季節(jié)如雨量偏多則 DON 的污染更為嚴(yán)重。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇不僅可以導(dǎo)致動(dòng)物：產(chǎn)生急性毒性、生殖毒性、免疫毒性，而且與人的癌癥相關(guān)。及時(shí)對食品及其原料中的DON進(jìn)行檢測，防止其污染的食品進(jìn)入食物鏈，是預(yù)防真菌毒素對人和動(dòng)物帶來

2、危害的主要手段。 SELEX技術(shù)即配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)，是一種新型的體外篩選技術(shù)。適配子(aptamer) 是運(yùn)用 SELEX 技術(shù)從體外人工合成的隨機(jī)寡核苷酸庫中反復(fù)篩選得到的、能以極高的親和力和特異性與靶分子結(jié)合的一段或者幾段寡核苷酸序列。 適配子的功能類似于抗體但明顯優(yōu)于抗體，具

3、有靶分子范圍廣、親和力和特異性高、制備方便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在臨床治療和診斷方法等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究旨在運(yùn)用SELEX技術(shù)從人工體外合成的隨機(jī)ssDNA文庫中篩選到針對DON的特異性適配子，為建立檢測DON的快速而簡便的方法奠定基礎(chǔ)。 本研究先將毒素DON連接到蛋白質(zhì)上合成全抗原。體外合成一個(gè)全長87個(gè)核苷酸中間含45個(gè)隨機(jī)序列的隨機(jī) ssDNA 文庫，以偶聯(lián)有DON的全抗原為靶分子，通過SELEX技術(shù)篩選DON特

4、異性適配子，利用生物素-鏈親和素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測每輪ssDNA文庫與DON的親和力，將最后一輪篩選產(chǎn)物克隆測序并運(yùn)用相關(guān)軟件進(jìn)行適配子序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。 經(jīng)過10輪的篩選和擴(kuò)增，得到了DON特異性的適配子，每輪ssDNA文庫與DON的親和力呈上升趨勢。21個(gè)適配子序列全長 87 bp，根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)序列的同源性確定，一共有12種不同的核苷酸序列。其中7號(hào)適配子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，親和力高，其序列將是我們今后研究的重點(diǎn)。二級(jí)