脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒性和生物轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、真菌毒素是由真菌或霉菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛污染各種飼料原料和成品飼料。動(dòng)物食入被真菌毒素污染的飼料會(huì)造成動(dòng)物的真菌毒素中毒。 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是禾谷鐮刀菌在生長(zhǎng)的過程中產(chǎn)生的一種主要代謝產(chǎn)物，是單端孢霉烯族毒素中的一種，廣泛污染各種谷物和飼料。 本論文主要研究在常規(guī)污染劑量下DON對(duì)小鼠的毒性和對(duì)其生物轉(zhuǎn)化方發(fā)法。 試驗(yàn)Ⅰ脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)小鼠的生長(zhǎng)性能、血液生化和組織病理學(xué)的影響。

2、 昆明小鼠40只，分為4組，每組10只，雌雄各半，分別飼喂1mg kg<'1>DON+基礎(chǔ)日糧(1mgDON組)、3mgkg<'-1> DON+基礎(chǔ)日糧(3mgDON組)、5mg kg<'-1>DON+基礎(chǔ)日糧飼料(5mgDON紐)和基礎(chǔ)日糧(對(duì)照組)。飼喂20天后分別測(cè)定生長(zhǎng)性能、血清生化、血常規(guī)和免疫器官的重量(胸腺，脾臟)等指標(biāo)，并且觀察肝臟、脾臟、十二指腸、胃、腎臟和胸腺的病理變化。結(jié)果表明5mg DON組在增重、飼料轉(zhuǎn)化率、免

3、疫器官的重量(胸腺，脾臟)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均紅細(xì)胞體積和血小板計(jì)數(shù)等方面與對(duì)照組相比差異顯著；而1mg DON組和3mg DON組與對(duì)照組相比差異均不顯著。在生化方面，5mg DON組血清中的總蛋白、球蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯等方面與對(duì)照組相比較差異顯著。5mg DON組的組織器官的病理變化主要表現(xiàn)為：肝臟的淤血、凋亡細(xì)胞增加、細(xì)胞間的界限不明顯、部分細(xì)胞核消失和部分肝細(xì)胞腫脹；脾臟被膜增厚、脾小

4、梁增生、部分脾細(xì)胞變性壞死、脾臟淤血；胸腺的局部出血；胃絨毛的萎縮和局部出血；十二指腸腸絨毛萎縮或脫落；心肌萎縮、心肌變性、心肌細(xì)胞腫脹和腎臟髓質(zhì)出血、腎小球內(nèi)有浸出物和部分上皮細(xì)胞變性等。 試驗(yàn)Ⅱ脫氧雪腐鐮刀烯醇對(duì)CHO-K1和HL-7702細(xì)胞系的細(xì)胞毒性在培養(yǎng)基中加入不同濃度DON(DON終濃度分別為0ng mL<'-1>，100ng m<'-1>，200ng mL<'-1>，400ng mL<'-1>，800ng mL<

5、'-1>)，分別用MTT法測(cè)定DON對(duì)中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)和人肝細(xì)胞(HL-7702)的毒性作用，用放射免疫法測(cè)定細(xì)胞上清液中的白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度。結(jié)果表明在低濃度時(shí)DON對(duì)細(xì)胞上清液中(100～200 ng mL<'-1>)IL-2、IL-6和TNF-α的濃度沒有明顯的抑制作用，但是在高濃度(400～800 ng mL<'-1>)時(shí)，卻抑制了它們的表達(dá)。通過

6、MTT法測(cè)得CHO-K1和HL-7702的半抑制濃度(IC<,50>)分別為123.5ng mL<'-1>和336.2 ng mL<'-1>。同時(shí)在高濃度(400～800 ng mL<'-1>)時(shí)能明顯抑制CHO-K1和HL-7702的生長(zhǎng)。試驗(yàn)Ⅲ脫氧雪腐鐮刀茵烯醇生物轉(zhuǎn)化茵的分離和鑒定以脫氧雪腐鐮刀茵烯醇(DON)為唯一碳源，通過富集培養(yǎng)從土壤中分離到一株可以生物轉(zhuǎn)化DON的真菌，編號(hào)為NJA-1。用真菌通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增

7、了該菌的ITS區(qū)間，包括ITS1和ITS2，擴(kuò)增片段大小為565bp，通過在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫上比較將該菌鑒定了屬，然后用種間引物Bt2a和Bt2b擴(kuò)增了該菌的β-tubulin基因序列，擴(kuò)增片段大小為511pb。通過ITS和β-tubulin基因序列分析和形態(tài)學(xué)觀察最終鑒定該菌株為塔賓曲霉。該菌的β-tubulin基因序列在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB的登錄號(hào)為DQ902579，其與塔賓曲霉

8、AY820009的相似性為99％。 試驗(yàn)Ⅳ NJA-1菌的體外生物轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測(cè)把NJA-1加入含有不同濃度DON的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30℃， 120r min<'-1>，振蕩培養(yǎng)14d后，可以轉(zhuǎn)化94.4％的DON。最高濃度達(dá)到40mg L<'-1>。分別用薄層層析(TLC)，高效液相色譜(HPLC)和高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)對(duì)DON的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明在365nm紫外燈下檢測(cè)可見其具有熒光

9、。HPLC檢測(cè)其既有紫外吸收(波長(zhǎng)：218nm)和熒光吸收(Ex=340，Em=450)。HPLC-MS檢測(cè)其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的相對(duì)分子量為314.4，其分子量比DON大18.1，證明NJA-1可以水解DON。 試驗(yàn)Ⅴ生物轉(zhuǎn)化茵NJA-1對(duì)飼料中DON的轉(zhuǎn)化效果昆明小鼠40只，分為4組，每組10只，雌雄各半，分別飼喂基礎(chǔ)日糧(對(duì)照組)5mg kg <'1>DON+5g kg <'1>NJA-1菌(菌+DON組)、5mg kg<'-1>D

10、ON+基礎(chǔ)日糧(5mgDON組)、5g kg <'1>NJA-1菌+基礎(chǔ)日糧飼料(菌組)和。飼喂20天后分別測(cè)定生長(zhǎng)性能、血清生化、血常規(guī)和免疫器官的重量(胸腺，脾臟)等指標(biāo)，并且觀察肝臟、脾臟、十二指腸、胃、腎臟和胸腺的病理變化。試驗(yàn)結(jié)果表明在飼料添加5g kg<'-1>的NJA-1菌能減少DON引起的毒性作用。同時(shí)在飼料中添加5g kg<'-1>的NJA-1茵沒有對(duì)昆明小鼠造成明顯的副作用，該試驗(yàn)為NJA-1菌的進(jìn)一步應(yīng)用研究奠定了