脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)人工抗原合成及其ELISA檢測方法的研究.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是禾谷鐮刀菌的一種次級代謝產(chǎn)物，屬單端孢霉烯族化合物，主要污染谷物及其制品，溫帶地區(qū)DON的污染比較嚴重，尤其是在開花季節(jié)或收割季節(jié)雨量偏多時。人和動物食用污染DON的糧食和飼料后不僅可導致急慢性中毒，而且與很多疾病密切相關(guān)。DON分布范圍分廣泛，由于其對人和動物的危害及帶來的經(jīng)濟損失，各國對DON的研究逐步深入，但是我國的相關(guān)研究相對較少，特別是檢測水平偏低。因此，建立針對脫氧

2、雪腐鐮刀菌烯醇的快速檢測方法在防止動物飼料真菌毒素中毒、控制食品的衛(wèi)生質(zhì)量、保障消費者健康、保證畜牧業(yè)正常發(fā)展等方面具有十分重要的社會意義和經(jīng)濟意義。 本論文通過對DON人工抗原合成的研究，建立了DON的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法。用兩種合成方法對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與載體蛋白進行偶聯(lián)，分別做為免疫抗原和包被抗原用于ELISA檢測方法的研究，同時對ELISA檢測條件進行優(yōu)化，最終建立DON的ELISA檢測方法，并對收集的樣品進行檢測分析

3、。其主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1、通過兩種方法——琥珀酸酐法和N，N'-羰基二咪唑法實現(xiàn)了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和大分子蛋白質(zhì)(BSA/OVA)的偶聯(lián)，并用紫外分光光度法和SDS-PAGE法對偶聯(lián)物進行了定性檢測，然后用ELISA試劑盒測得偶聯(lián)物中DON的含量，其中與BSA偶聯(lián)的偶聯(lián)物中DON濃度為0.797μg/μL，與OVA偶聯(lián)的偶聯(lián)物中DON的濃度為0.518μg/μL。 2、將合成的DON人工抗原與等量佐劑混合后，采

4、用頸背部皮下多點注射免疫昆明小鼠和Balb/c小鼠，每次免疫后采血，分離血清，并用ELISA檢測方法檢測血清效價，監(jiān)測抗體產(chǎn)生情況，最終發(fā)現(xiàn)6次免疫后抗體效價最高。 3、對間接ELISA檢測條件進行優(yōu)化，包括包被液的包被時間和溫度、一抗孵育時間、HRP酶標羊抗鼠抗體的孵育時間及底物加樣后溫育時間，并用L16(45)正交表對這4個因素進行正交實驗。正交實驗證明，加好包被液的酶標板4℃冰箱過夜包被；一抗37℃溫育時間是60 min；

5、二抗37℃溫育時間是60 min；加底物顯色10 min后產(chǎn)生的陰陽性抗血清的OD450差值最大。包被液的包被條件對實驗結(jié)果的影響最大，其次是一抗和底物作用時間。由于二抗的溫育時間對實驗的結(jié)果影響不大，而且二抗溫育30 min和溫育120 min產(chǎn)生的實驗結(jié)果相差很小。但從節(jié)約時間和不降低實驗靈敏度的角度考慮，二抗的孵育時間定為60 min。 4、實驗表明：乙腈-水(84:16)對DON具有更好的提取效果；加標回收率為86.4～