脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的遺傳毒性研究.pdf

1、霉菌毒素是由霉菌或真菌產(chǎn)生的有毒有害的二級(jí)代謝產(chǎn)物。在土壤中、植物上、谷物、飼草和青貯飼料等均可發(fā)現(xiàn)霉菌毒素。霉菌毒素可在農(nóng)作物收獲時(shí)形成。在不適宜的貯存條件下,霉菌毒素也可繼續(xù)在收獲后的農(nóng)作物上形成。世界上每年大約有25％谷物遭受各種霉菌污染,因污染程度不同,不同地區(qū)差距很大,而中國(guó)是霉菌毒素污染的重災(zāi)區(qū)之一。
　　脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又稱嘔吐毒素,它能夠?qū)θ梭w健康造成極大的傷害。它主要是由鐮刀菌的某些種菌產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性

2、相似的有毒代謝產(chǎn)物——單端孢霉烯族化合物中的一種。DON的主要產(chǎn)生菌是禾谷鐮刀菌,據(jù)報(bào)道也有其它一些鐮刀菌可產(chǎn)生。DON屬于劇毒類,以往的研究中表明:DON在體內(nèi)可能有一定的蓄積,且具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,但無特殊的靶器官。人畜誤食了被DON污染的食物/飼料后,會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀,嚴(yán)重時(shí)會(huì)損害造血系統(tǒng)造成死亡。
　　目前,在食品安全和基礎(chǔ)毒理學(xué)研究(致畸)中也發(fā)現(xiàn),DON能夠在很多的食品中以

3、極低的含量檢測(cè)出。如大、小麥制品可檢出1ppm的DON含量、4月齡雞肉中可檢測(cè)出10ppm的DON含量,豬肉中可檢出5ppm的DON含量以及酒類中均能檢測(cè)出DON的存在。毒理學(xué)研究指出:100ng/mL的DON能導(dǎo)致細(xì)胞分裂指數(shù)下降、細(xì)胞炎性物質(zhì)過度表達(dá)和細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的情況。低劑量的DON能造成V79細(xì)胞出現(xiàn)微核及染色體畸變;經(jīng)口灌服(1000mg/kg)能致使胎鼠和仔雞的骨骼畸形和小鼠生殖細(xì)胞數(shù)量下降以及細(xì)胞形態(tài)發(fā)生畸形。綜上所述,不

4、同劑量的DON能致使動(dòng)物臟器和細(xì)胞受到不同程度的損傷,特別是生殖細(xì)胞的數(shù)量和活力的下降,這也提示了,DON可能具有潛在的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。然而,迄今為止,文獻(xiàn)中關(guān)于DON對(duì)人原代細(xì)胞是否有遺傳毒性和其毒性的分子毒理學(xué)的研究還比較少。
　　因此,本研究的目的在于:利用人外周血淋巴細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察DON對(duì)人原代細(xì)胞的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。并利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)細(xì)胞毒性和遺傳毒性進(jìn)行分子層面的研究。
　　第一部分脫氧雪腐鐮刀

5、菌烯醇導(dǎo)致人外周血淋巴細(xì)胞的遺傳毒性研究
　　目的:以人外周血淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察DON對(duì)人淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制作用(IC50)、對(duì)人淋巴細(xì)胞DNA的損傷作用,以及對(duì)人淋巴細(xì)胞染色體損傷的作用。方法:(1)志愿者均為健康人員,血樣采集前需經(jīng)過知情同意書的填寫和個(gè)人健康狀況的詢問,包括:是否在近期接受過藥物治療、是否有遺傳病和傳染病以及是否有不良嗜好(抽煙或酗酒)等。(2)全血樣本用淋巴細(xì)胞分離液分離提取淋巴細(xì)胞,隨后用PRM

6、I1640培養(yǎng)液重懸,并接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。(3)利用CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力,并計(jì)算IC50數(shù)值。(4)利用單細(xì)胞凝膠電泳法,檢測(cè)DON對(duì)淋巴細(xì)胞 DNA的損傷程度。(5)在微核試驗(yàn)中利用細(xì)胞松弛素-B阻滯法檢測(cè)DON暴露下的淋巴細(xì)胞微核的產(chǎn)生情況。(6)利用姐妹染色體交換法,觀察DON造成人淋巴細(xì)胞染色體損傷的程度。結(jié)果:(1)在

7、染毒DON24h后,細(xì)胞活力從98.07±0.10％(0ng/mLDON)下降到14.03±1.78％(500ng/mLDON)(P<0.01)。兩性細(xì)胞樣本的IC50為:男---103.7±2.83ng/mL;女---101.4±3.15ng/mL,男性樣本和女性樣本的IC50之間無性別差異(P>0.05)。(2)在染毒24h后,與陰性對(duì)照組相比,DON組的Tail length、Tail DNA％和Tail moment的數(shù)值明顯增

8、加(P<0.01)。(3)微核試驗(yàn)的結(jié)果顯示,DON的暴露能明顯增加人淋巴細(xì)胞中微核的數(shù)量。染毒組微核數(shù)量明顯高于陰性對(duì)照組(23.86±4.11‰,0ng/mL DONvs109.66±9.81‰,50ng/mLDON,24h,P<0.01)。(4)姐妹染色體交換的結(jié)果表明,與陰性對(duì)照組相比,DON暴露24 h后能明顯的破壞染色體結(jié)構(gòu),使染色體缺失或畸形的數(shù)量明顯上升(62±13.01/30cells,0ng/mL DONvs206.

9、17±18.40/30cells,50ng/mLDON,24h,P<0.01)。結(jié)論:(1)DON的暴露能明顯抑制人淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活力。提示DON具有潛在的細(xì)胞毒性。(2)人淋巴細(xì)胞暴露于DON環(huán)境中,細(xì)胞的DNA損傷程度、微核數(shù)量以及染色體損傷數(shù)量明顯增加。提示DON具有潛在的遺傳毒性特征。
　　第二部分脫氧雪腐鐮刀菌烯醇導(dǎo)致人外周血淋巴細(xì)胞氧化應(yīng)激的機(jī)制研究
　　目的:以人外周血淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象,探討DON造成的氧化應(yīng)

10、激與DNA損傷和染色體損傷之間的關(guān)系。方法:(1)人群血樣采集與細(xì)胞提取過程和培養(yǎng)方法參照第一部分。(2)利用高效液相色譜法對(duì)DON導(dǎo)致人外周血淋巴細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析。(3)利用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)GSH含量及GSSG的含量進(jìn)行定量和定性分析。(4)利用熒光探針法(DCFH-DA)裝載細(xì)胞培養(yǎng)基,對(duì)細(xì)胞中ROS的含量進(jìn)行定量分析,并利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行熒光定性分析。(5)利用Annexi

11、n V-FITC探針法裝載細(xì)胞后,在流式細(xì)胞儀中對(duì)膜損傷情況進(jìn)行定量分析。(6)利用ELISA法檢測(cè)DNA氧化性損傷標(biāo)志物(8-OHdG)在人淋巴細(xì)胞中的含量,對(duì)DNA損傷進(jìn)行初步的評(píng)估。結(jié)果:(1)人外周血淋巴細(xì)胞染毒DON后(24h),與陰性對(duì)照組相比,DON組的MDA的含量明顯上升。(2)人外周血淋巴細(xì)胞染毒DON后(24h),與陰性對(duì)照組相比,DON組中GSH的含量明顯下降,GSSG的含量隨之升高。(3)人外周血淋巴細(xì)胞染毒DO

12、N后(24h),與陰性對(duì)照組相比,ROS熒光探針的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間-劑量而增強(qiáng)。并且在激光共聚焦顯微鏡成像圖中,可以觀察到細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng),細(xì)胞形態(tài)由正常形態(tài)逐漸變的固縮及變形,細(xì)胞膜逐漸失去光澤并呈現(xiàn)出不規(guī)則表面。(4)在DON暴露24h后,FITC探針與細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)的結(jié)合強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。(5)DON暴露24h后,染毒組8-OHdG的含量明顯高于陰性對(duì)照組。結(jié)論:(1)DON能造成氧自由基的增多削弱抗氧化酶的活力,致使細(xì)胞內(nèi)(膜)的過

13、氧化加劇。(2)細(xì)胞壞死的數(shù)量和細(xì)胞膜變形,可能與DON造成的氧自由基增高有關(guān)。(3)由于DON使8-OHdG的含量明顯上升,提示DON導(dǎo)致人淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性和遺傳毒性與DON導(dǎo)致DNA氧化性損傷有關(guān)。
　　第三部分脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞遺傳毒性的分子毒理學(xué)機(jī)制
　　目的:以人淋巴細(xì)胞染毒DON為體外模型,利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探討DON對(duì)人淋巴細(xì)胞遺傳毒性的分子毒理學(xué)機(jī)制。方法:(1)人群血樣采樣和細(xì)胞培

14、養(yǎng)方法均與第一部分相同。(2)利用RT-PCR法,測(cè)定人淋巴細(xì)胞在染毒DON6、12和24h后的DNA修復(fù)相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)水平。(3)利用Western-Blot法檢測(cè)堿基切除修復(fù)關(guān)鍵基因hOGG1和XRCC1的蛋白表達(dá)水平。(4)利用Western-Blot法檢測(cè)HO-1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:(1)RT-PCR的結(jié)果顯示,DNA修復(fù)相關(guān)基因和HO-1均在6h時(shí)表達(dá)明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.01),并在染毒12h時(shí),出現(xiàn)下降的

15、趨勢(shì)(P<0.05)。在24h時(shí),與陰性對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。(2)Western-Blot的結(jié)果提示,與陰性對(duì)照組相比,堿基切除修復(fù)機(jī)制中的關(guān)鍵基因hOGG-1和XRCC1的蛋白表達(dá)水平在短時(shí)間內(nèi)明顯升高(P<0.01)。而在12h時(shí),hOGG-1的蛋白表達(dá)水平逐漸下降(P<0.05),XRCC-1卻沒有顯著性差異(P>0.05)。在24h時(shí),hOGG-1和XRCC1的蛋白表達(dá)水平均與陰性對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)

16、。(3)Western-Blot的結(jié)果表明,染毒6、12和24h后,與陰性對(duì)照組相比,HO-1的蛋白表達(dá)水平在6h時(shí)明顯升高(P<0.05)。但在染毒12和24小時(shí)后,沒有顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論:(1)結(jié)果提示,DON能夠在短時(shí)間內(nèi)刺激DNA修復(fù)能力的提升,但DON濃度的增加和染毒時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)抑制DNA修復(fù)能力。(2)Western-Blot的結(jié)果表明hOGG-1、HO-1和XRCC-1在6h時(shí),有表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。而在12和2

17、4h時(shí),與陰性對(duì)照組相比較無明顯差異。HO-1的表達(dá)抑制可能與DNA修復(fù)能力下降有關(guān)。
　　本研究的創(chuàng)新之處：
　　(1)本研究驗(yàn)證了DON能夠?qū)θ送庵苎馨图?xì)胞造成遺傳毒性。(2)本研究從DNA損傷/修復(fù)和氧化應(yīng)激兩方面探討DON遺傳毒性的分子毒理學(xué)機(jī)制,進(jìn)而證明氧化應(yīng)激與DON的遺傳毒性有關(guān)。(3)DON可能通過抑制HO-1的表達(dá),造成淋巴細(xì)胞內(nèi)高氧化應(yīng)激狀態(tài)而導(dǎo)致DNA損傷。進(jìn)而證明HO-1可能是DON導(dǎo)致人外周血淋巴