SELEX技術篩選泡沫細胞適配子.pdf

1、目的:利用SELEX技術篩選靶向巨噬細胞源性泡沫細胞的寡核苷酸適配子,并初步鑒定其與巨噬細胞源性泡沫細胞及動脈粥樣硬化病變結合的特異性。
　　方法:體外培養(yǎng)的THP-1細胞,經100nmol/L PMA孵育72小時,誘導其分化成巨噬細胞,然后用80mg/L氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)孵育72小時,建立泡沫細胞模型,通過油紅O染色觀察細胞內脂滴,HPLC檢測細胞內膽固醇含量。體外合成一個含35個核苷酸隨機序列、總長81nt、庫容

2、量大約為1015-16的ssDNA文庫;優(yōu)化了ssDNA庫PCR反應條件,用生物素和FITC標記的引物擴增為dsDNA文庫并以生物素-鏈霉親和素磁珠分離方法構建FITC標記的ssDNA文庫;以六孔板為篩選介質,ssDNA文庫先分別與大鼠血管平滑肌細胞和THP-1巨噬細胞結合,反篩除去與其結合的ssDNA,然后與巨噬細胞源性泡沫細胞結合,洗脫與其結合的ssDNA,PCR擴增構建次級FITC標記的ssDNA文庫進行下一次篩選。利用熒光顯微鏡

3、觀察每輪FITC標記的ssDNA文庫與大鼠血管平滑肌細胞、THP-1巨噬細胞和巨噬細胞源性泡沫細胞結合的情況。將最后一輪篩選后得到的ssDNA用無標記的引物PCR擴增,轉入JM109大腸桿菌中克隆和測序。應用DNA MAN軟件和RNA structer4.2軟件對每一個適配子的保守序列和二級結構進行分析,篩選出文庫中富集程度最高、結構特點最明顯的適配子進行體外合成,FITC標記后,利用熒光顯微觀察及PCR方法鑒定其與巨噬細胞源性泡沫細胞

4、及動脈粥樣硬化病變結合的特異性。
　　結果:1、THP-1細胞經oxLDL處理后,油紅O染色觀察到細胞內脂滴明顯增多,HPLC檢測發(fā)現細胞內的膽固醇含量顯著增加,由6.5±3.8 ug/mg升至103.7±3.6ug/mg,膽固醇脂/總膽固醇大于50％,說明泡沫細胞模型建立成功。
　　2、通過條件優(yōu)化,確立以退火溫度72℃為基礎的ssDNA文庫PCR反應條件,用FITC、Biotin標記的引物可擴增為dsDNA。標記有FIT

5、C和Biotin的dsDNA經鏈親和素磁珠結合、0.15mol/L的NaOH變性后,可制備出產物量大,純度高,符合SELEX篩選要求的FITC標記ssDNA文庫。
　　3、SELEX篩選過程中,隨著篩選輪數的增加,文庫中寡核苷酸與泡沫細胞結合的特異性逐漸增強。經過18輪篩選,與泡沫細胞結合的ssDNA得到了富集和進化,而隨機文庫中的ssDNA幾乎不再與平滑肌細胞、THP-1巨噬細胞結合。
　　4、將第18輪篩選后得到的ssD

6、NA PCR擴增后克隆測序,發(fā)現所有的適配子的一級結構沒有共同的同源序列,但可以分為12個家族:家族1含有保守序列CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT,家族2含有保守序列 TGGTG,家族3兩條序列完全一致,家族4含有保守序列CGTGG,家族5含有保守序列TTGTG,家族6含有保守序列GGCCC,家族7含有保守序列GGGTG,家族8含有保守序列TGTGTGG,家族9含有保守序列TTGGC,家族10含有保守序列TCTGCT,

7、家族11含有保守序列CCACGG,家族12共5個無保守序列。二級結構預測分析表明,適配子主要形成莖環(huán)或發(fā)夾結構,這些結構特征可能是適配子與巨噬細胞源性泡沫細胞結合的結構基礎。
　　5、通過對適配子一級結構和二級結構分析,篩選出文庫中富集程度最高、結構特點最明顯23號和40號適配子并進行FITC標記。通過熒光顯微觀察發(fā)現23號和40號適配子能特異性結合巨噬細胞源性泡沫細胞,而不與血管平滑肌細胞、巨噬細胞及血管內皮細胞結合;通過PCR