SELEX技術(shù)體外篩選單增李斯特菌適配子及其熒光快速檢測(cè)方法的建立.pdf

1、目的：本文采用SELEX技術(shù)，以單核細(xì)胞增生李斯特菌為靶目標(biāo)，篩選得到一組擁有高親和力和高特異性的寡核苷酸適配子，并初步建立單核細(xì)胞增生李斯特菌的熒光快速檢測(cè)方法。
　　方法：
　　1.以單核細(xì)胞增生李斯特菌為靶目標(biāo)，人工合成兩端為固定序列，中間含37個(gè)隨機(jī)序列，全長(zhǎng)為80nt長(zhǎng)度的ssDNA文庫(kù)。應(yīng)用SELEX技術(shù)進(jìn)行反復(fù)9輪篩選，得到一組高親和力和高特異性的適配子群。為了減少ssDNA與其他細(xì)菌的交叉結(jié)合，在第5輪用蠟樣

2、芽孢桿菌進(jìn)行反篩，在第7輪用英諾克李斯特菌進(jìn)行反篩。利用地高辛-抗地高辛堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)檢測(cè)各輪篩選產(chǎn)物與單核細(xì)胞增生李斯特菌的結(jié)合率。
　　2.最后一輪的篩選產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、純化，克隆、測(cè)序。應(yīng)用Chromas2軟件分析適配子的測(cè)序峰圖，DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序出來(lái)的適配子序列一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源性分析，并用RNAStructure軟件預(yù)測(cè)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　3.通過(guò)對(duì)適配子結(jié)合力和特異性檢測(cè)，選取最佳的一條適配子，運(yùn)用熒光結(jié)

3、合機(jī)制來(lái)設(shè)計(jì)分別標(biāo)記有FAM和TAMRA的兩種熒光適配子，初步建立熒光標(biāo)記適配子直接檢測(cè)法（FLADA）。
　　結(jié)論：
　　1.隨著篩選輪數(shù)的增加，篩選條件越來(lái)越嚴(yán)格，最終得到一組高親和力和高特異性的適配子群，初步建立了SELEX體外篩選單核細(xì)胞增生李斯特菌適配子的技術(shù)。利用克隆技術(shù)成功的將篩選獲得的適配子進(jìn)行克隆，測(cè)序，并將得到的18條序列分為A、B、C三組。A組中的15條序列的隨機(jī)區(qū)片段長(zhǎng)度和預(yù)期片段的隨機(jī)區(qū)長(zhǎng)度一致，B

4、組中2條序列的隨機(jī)區(qū)片段短于預(yù)期片段的隨機(jī)區(qū)長(zhǎng)度，C組中的1條序列的隨機(jī)區(qū)片段比預(yù)期的多了一個(gè)堿基。運(yùn)用DNAMAN軟件分析18條克隆適配子一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性，除H09序列剩下的17條序列都有較高的同源性，說(shuō)明經(jīng)過(guò)9輪SELEX篩選，一級(jí)結(jié)構(gòu)同源的適配子得到了一定程度的富集。應(yīng)用RNAStructure軟件模擬適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主。
　　2.利用地高辛-抗地高辛堿性磷酸酶顯色體系對(duì)適配子的結(jié)合率進(jìn)行測(cè)定，從得到的18個(gè)克

5、隆適配子中選取結(jié)合率最高的E01號(hào)適配子，并將E01號(hào)適配子與多種菌種結(jié)合，進(jìn)行特異性檢測(cè)，E01號(hào)適配子與目標(biāo)菌單核細(xì)胞增生李斯特菌的結(jié)合力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他菌種，高達(dá)1.017，說(shuō)明了E01號(hào)適配子的高特異性。
　　3.選擇FAM和TAMRA兩種熒光基團(tuán)對(duì)E01號(hào)適配子進(jìn)行標(biāo)記，熒光顯微鏡下可以直接觀測(cè)到適配子與單核細(xì)胞增生李斯特菌孵育后有較強(qiáng)的熒光，而與蠟樣芽孢桿菌和英諾克李斯特菌結(jié)合的數(shù)量就很少。熒光標(biāo)記適配子與我們目標(biāo)菌的檢測(cè)