SELEX技術(shù)篩選弓形蟲與巨細(xì)胞病毒抗體適配子及其SPR傳感器快速檢測抗體的方法學(xué)研究.pdf

1、背景：
　　 目出生缺陷給家庭、國家和社會帶來極大的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，臨床對胎兒的先天性缺陷尚無有效的治療方法。出生缺陷疾病預(yù)防的方法中，孕前期的一級預(yù)防最為有效。TORCH是一組孕期感染的病原微生物，能通過胎盤或產(chǎn)道引起宮內(nèi)感染，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎或胎兒生長遲緩、先天畸形、新生兒期感染及嬰、幼兒生長發(fā)育障礙。我國每年約有26，000個TORCH感染患兒出生，平均每小時就有3個，因此，TORCH篩查是孕前感染性疾病檢查的重要內(nèi)容

2、。但是，據(jù)統(tǒng)計資料顯示，我國目前診斷臨床普遍采用ELISA法、金標(biāo)法等檢測孕齡婦女血清TORCH-IgG和TORCH-IgG的水平，假陽性率較高，不能為臨床提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)。
　　 適配子(aptamers)是人工合成的寡核苷酸片段，近年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。適配子能識別靶物質(zhì)上的微妙結(jié)構(gòu)，因此具有極高的特異性。與傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的抗體相比，寡核苷酸適配子還具與靶分子結(jié)合力更強(qiáng)、穩(wěn)定性好、精確性高、重復(fù)性好、可反復(fù)使用、

3、可長期保存、可進(jìn)行精確的位點修飾、篩選期更短等優(yōu)勢，是一種高效、快速的檢測手段。同時，近年來表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)因其具有實時監(jiān)測反應(yīng)動態(tài)過程、靈敏度較高、無需標(biāo)記、無背景干擾、成本低廉等特點，被認(rèn)為是生物分子檢測的理想檢測器件，已經(jīng)成為臨床實驗診斷領(lǐng)域研究的熱點。
　　 本研究擬基于課題組原有工作基礎(chǔ)上，將適配子同靶分子結(jié)合的高特異性和SPR傳感器的高靈敏性相結(jié)合，構(gòu)

4、建一種新型TORCH快速檢測適配子型SPR傳感器微陣列檢測系統(tǒng)，努力為基層提供一種提供簡單方便快速準(zhǔn)確的TORCH實驗室檢測方法。
　　 目的：
　　 利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)篩選能與弓形蟲蛋白抗體，巨細(xì)胞病毒蛋白抗體特異結(jié)合的寡核苷酸適配子。并初步構(gòu)建弓形蟲與巨細(xì)胞病毒(TOX、CMV)IgG抗體的SPR傳感器微陣列的快速方法檢測，為實時、在線監(jiān)測病原菌的抗體奠定一定的技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 方法：

5、
　　 體外合成長度為78個核苷酸的隨機(jī)ssDNA文庫，利用SELEX技術(shù)篩選，以弓形蟲蛋白抗體，巨細(xì)胞病毒抗體為靶物質(zhì)進(jìn)行12輪篩選，利用生物素一親和素顯色系統(tǒng)檢測寡核苷酸與蛋白的結(jié)合性。將篩選到的適配子庫進(jìn)行克隆、測序后，用DNAMAN軟件對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并利用捕獲適配子與檢測適配子組成的“三明治”夾心法對獲得的適配子進(jìn)行初步驗證。采用SELEX技術(shù)篩選TOX-IgG與CMV-IgG的適配子，并將其整合于表面等離子共振生物

6、傳感器實時在線分析系統(tǒng)，我們通過在傳感器表面進(jìn)行固定探針分子，對溶液中的TOX-IgG與CMV-IgG進(jìn)行雜交檢測，并進(jìn)一步研究其檢測方法的穩(wěn)定性和線性檢范圍。
　　 結(jié)果：
　　 SELEX技術(shù)篩選弓形蟲蛋白抗體適配子，巨細(xì)胞病毒蛋白抗體適配子的技術(shù)體系：PCR擴(kuò)增的最佳退火溫度為65℃；文庫優(yōu)化時，最佳Mg2+的濃度為1.5mmol/L；不對稱PCR法制備ssDNA時，Mg2+的濃度為0.75mmol/L；以酶聯(lián)板為

7、介質(zhì)篩選時，在10輪后篩選達(dá)到飽和，且隨著篩選輪數(shù)的增加，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶逐漸單一、致密，親和性檢測顯示第10輪獲得的適配子庫，弓形蟲蛋白抗體比初始的文庫親和性吸光度(A)值增加了7.2倍；巨細(xì)胞病毒蛋白抗體比初始的文庫親和性吸光度(A)值增加了8倍。將適配子庫克隆，隨機(jī)挑取7個單克隆子，利用混合夾心法檢測其與弓形蟲蛋白抗體，巨細(xì)胞病毒蛋白抗體的親和性，親和性范圍分布在1.095-2.129之間(弓形蟲)與1.008-2.148

8、之間(巨細(xì)胞病毒)。二級結(jié)構(gòu)分析顯示，適配子與蛋白抗體親和性的基礎(chǔ)主要是大口袋莖環(huán)結(jié)構(gòu)，口袋與環(huán)之間的莖橋含有不同數(shù)量的GC與AT堿基對；“三明治”夾心法對陰性組(非弓形蟲與巨細(xì)胞病毒陽性血清)和陽性組(弓形蟲抗體標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、巨細(xì)胞病毒抗體標(biāo)準(zhǔn)陽性血清以及60例巨細(xì)胞病毒與弓形蟲陽性血清標(biāo)本)共75例血清樣本的檢測結(jié)果顯示，在臨界(cut-off)值為1.42時，陰性組標(biāo)本的陰性檢出率為84.6%(弓形蟲)與92.3%(巨細(xì)胞病毒)，