風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒抗體時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測(cè)試劑的研制.pdf

1、背景及目的：
　　風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒都是TORCH篩查的重要組成病毒。風(fēng)疹是由風(fēng)疹病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，臨床癥狀輕微，但母體感染風(fēng)疹病毒可導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，特別在懷孕的前三個(gè)月期間發(fā)生感染，風(fēng)疹病毒可通過(guò)胎盤傳染，并可能導(dǎo)致胎兒死亡或可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重畸形胎兒，通常概括為先天性風(fēng)疹綜合征(CRS)。CRS是致盲、耳聾、先天性心臟疾病和智力低下的重要原因。巨細(xì)胞感染通常是輕微或無(wú)癥狀。然而，孕婦懷孕期間巨細(xì)胞病毒感染引起宮內(nèi)傳

2、播的危害性高，可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的胎兒損傷，包括生長(zhǎng)障礙和精神低下，黃疸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常。重癥感染出生患兒臨床上出現(xiàn)嗜睡、驚厥、呼吸窘迫綜合征等，可在數(shù)日或數(shù)周內(nèi)死亡，幸存者可出現(xiàn)智力障礙、運(yùn)動(dòng)障礙、耳聾等后遺癥。巨細(xì)胞病毒對(duì)血液病患者、腫瘤病人、移植受者、HIV感染者等免疫功能低下者中則可引起嚴(yán)重感染，甚至危及生命。
　　IgG、IgM抗體的血清學(xué)檢測(cè)可初步確定母體的感染情況，IgG抗體產(chǎn)生后可存在數(shù)年或終生，僅IgG陽(yáng)性提示既往

3、感染，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)IgG由陰性轉(zhuǎn)化為陽(yáng)性即血清轉(zhuǎn)化提示近期原發(fā)感染，恢復(fù)期血清比急性期血清的抗體滴度有4倍或4倍以上的升高，也可作出近期急性感染的診斷。測(cè)定IgG抗體的滴度，還可以了解人群風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒隱性感染水平和考核疫苗的免疫效果。IgM抗體通常在病毒感染后數(shù)天內(nèi)產(chǎn)生，可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月，IgM抗體陽(yáng)性是病毒急性感染的重要指標(biāo)。
　　時(shí)間分辨熒光免疫法(TRFIA)利用了具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘?價(jià)稀土離子及其螯合物為示蹤物代替熒光

4、物質(zhì)、酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等，標(biāo)記抗體/抗原，待抗原抗體反應(yīng)發(fā)生后，用TRFIA檢測(cè)儀測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，根據(jù)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達(dá)到定量分析。其中解離增強(qiáng)鑭系熒光免疫分析技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，多標(biāo)記技術(shù)則是時(shí)間分辨熒光免疫法(TRFIA)的最大亮點(diǎn)。
　　本研究應(yīng)用時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA）解離增強(qiáng)技術(shù)的特點(diǎn)及多標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，分別研制用于定

5、量檢測(cè)風(fēng)疹病毒IgG抗體，巨細(xì)胞病毒IgG抗體，同時(shí)檢測(cè)風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒IgM抗體的試劑，評(píng)價(jià)各項(xiàng)性能指標(biāo)，并與進(jìn)口試劑進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其臨床適用性。
　　方法：
　　1.采用TRFIA“間接法”分別定量檢測(cè)人血清中的風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒特異性IgG抗體。
　　1.1 包被特異性抗原:用包被緩沖液分別將風(fēng)疹病毒抗原和巨細(xì)胞病毒抗原稀釋至3μg/mL，按100μL/孔包被至96孔微孔反應(yīng)板中，經(jīng)封閉、抽干、真空包裝后成

6、特異性反應(yīng)板，2～8℃貯存。
　　1.2 銪標(biāo)記羊抗人IgG多克隆抗體:按照5∶1的標(biāo)記比例，取1mg的羊抗人IgG多克隆抗體進(jìn)行除雜等預(yù)處理，濃縮至4～5mg/mL后與0.2mg的DTTA-Eu充分混合，4℃反應(yīng)過(guò)夜，經(jīng)純化處理后，加入終濃度為0.1％的BSA作為保護(hù)劑，-20℃貯存。
　　1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備:用樣本稀釋液分別將混合的高值風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒IgG抗體血清稀釋至10，20，50，100，250IU/mL和

7、5，10，20，40，100 PEIU/mL，經(jīng)校正合格后，2～8℃貯存。
　　2.采用雙標(biāo)記TRFIA“捕獲法”同時(shí)定量檢測(cè)人血清中的風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒特異性IgM抗體。
　　2.1 包被抗μ鏈單克隆抗體:用包被緩沖液將抗μ鏈單克隆抗體稀釋至3μg/mL，按100μL/孔包被至96孔微孔反應(yīng)板中，經(jīng)封閉、抽干、真空包裝后成特異性反應(yīng)板，2～8℃貯存。
　　2.2 銪標(biāo)記風(fēng)疹病毒單克隆抗體:按照5∶1（質(zhì)量比）的標(biāo)記

8、比例，取1mg的風(fēng)疹病毒單克隆抗體進(jìn)行除雜等預(yù)處理，濃縮至4～5mg/mL后與0.2mg的DTTA-Eu充分混合，4℃反應(yīng)過(guò)夜，經(jīng)純化處理后，加入終濃度為0.1％的BSA作為保護(hù)劑，-20℃貯存。
　　2.3 釤標(biāo)記鏈霉親和素:按照2∶1（質(zhì)量比）的標(biāo)記比例，取0.4mg的鏈霉親和素進(jìn)行除雜等預(yù)處理，濃縮至4～5mg/mL后與0.2mg的DTTA-Sm充分混合，4℃反應(yīng)過(guò)夜，經(jīng)純化處理后，加入終濃度為0.1％的BSA作為保護(hù)劑，-

9、20℃貯存。
　　2.4 巨細(xì)胞病毒抗原生物素化:按照1∶25（摩爾比）的標(biāo)記比例，取1mg巨細(xì)胞病毒抗原進(jìn)行除雜等預(yù)處理，濃縮至約2mg/mL后與281μg生物素(NHS-LC-Biotin)充分混合，室溫反應(yīng)1h，經(jīng)純化處理后，加入終濃度為1mg/mLBSA和0.05％疊氮鈉作為保護(hù)劑，-20℃貯存
　　2.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備:用樣本稀釋液分別將混合的高值風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒IgM抗體血清稀釋至2，5，15，40，80 A

10、U/mL和5，20，80，200，400 AU/mL，經(jīng)校正合格后，2～8℃貯存。
　　3.試劑性能指標(biāo)的評(píng)價(jià)
　　3.1 陰性/陽(yáng)性參考品符合率:檢測(cè)商用血清盤（PTR201或PTC203）和國(guó)家血清盤，計(jì)算符合率。
　　3.2 劑量-反應(yīng)曲線:以參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，各濃度點(diǎn)信號(hào)值減去本底信號(hào)值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理。
　　3.3 分析靈敏度:以零參考標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定值的均值

11、加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差所得信號(hào)值減去本底信號(hào)值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得出的濃度，即為其靈敏度。
　　3.4 線性:將濃度值為高、低的血清樣本按系列倍比稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，將結(jié)果平均值和稀釋比例用最小二乘法進(jìn)行直線擬合，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。
　　3.5 回收率實(shí)驗(yàn):在特異性抗體常規(guī)檢查樣本中，加入相同體積不同濃度的特異性抗體標(biāo)準(zhǔn)液，制備回收樣本，計(jì)算回收率。
　　3.6 精密度實(shí)驗(yàn):在不同的時(shí)間三次實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定不同濃度的陽(yáng)性血清樣本

12、（高、中、低），分別計(jì)算一次實(shí)驗(yàn)的分析內(nèi)變異系數(shù)和三次實(shí)驗(yàn)的分析間變異系數(shù)。
　　3.7 交叉反應(yīng):選擇可能會(huì)對(duì)目的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的樣本進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.抗干擾實(shí)驗(yàn):對(duì)加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，比較樣本添加干擾物前、后的濃度變化。
　　3.9 與進(jìn)口試劑比對(duì)實(shí)驗(yàn):自制試劑與進(jìn)口對(duì)照試劑平行檢測(cè)樣本濃度后，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：
　　1.自制風(fēng)疹病

13、毒IgG抗體檢測(cè)試劑，分析靈敏度為0.12 IU/mL，檢測(cè)范圍達(dá)0.12～250 IU/mL，準(zhǔn)確度高，檢測(cè)回收樣本的回收率均在90％～110％范圍內(nèi)，分析內(nèi)和分析間精密度均＜10％。與進(jìn)口試劑進(jìn)行平行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，特異性符合率為:97.10％(67/69)，敏感性符合率為:99.42％(340/342)，經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)，P=1.000，表明兩種檢測(cè)方法無(wú)顯著差異;結(jié)合κ系數(shù)檢驗(yàn)，κ=0.965，P=0.000，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法吻合度有統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)意義且較強(qiáng)。
　　2.自制巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑，分析靈敏度為0.18 PEIU/mL，檢測(cè)范圍達(dá)0.18～100 PEIU/mL，準(zhǔn)確度高，檢測(cè)回收樣本的回收率均在90％～110％范圍內(nèi)，分析內(nèi)和分析間精密度均＜10％。與進(jìn)口試劑進(jìn)行平行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，臨床特異性符合率為:95.35％(41/43)，臨床敏感性符合率為:100.00％(368/368)，經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)，P=0.500，表明兩種檢測(cè)方法無(wú)顯著差異;結(jié)合κ系數(shù)檢

15、驗(yàn)，κ=0.973，P=0.000，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法吻合度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且較強(qiáng)。
　　3.自制雙標(biāo)記風(fēng)疹病毒/巨細(xì)胞病毒IgM抗體檢測(cè)試劑，分析靈敏度分別為0.15AU/mL、1.12AU/mL，檢測(cè)范圍分別為0.15～80.00AU/mL、1.12～400.00AU/mL，準(zhǔn)確度高，檢測(cè)回收樣本的回收率均在90％～110％范圍內(nèi)，分析內(nèi)和分析間精密度均＜10％。與進(jìn)口試劑進(jìn)行平行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，臨床特異性符合率分別為:99.15％(35

16、2/355)、98.27％(340/346)，臨床敏感性符合率分別為:96.43％(54/56)、93.85％(61/65)，經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)，P風(fēng)疹=1.000、P巨細(xì)胞=0.754，表明兩種檢測(cè)方法均無(wú)顯著差異;結(jié)合κ系數(shù)檢驗(yàn)，κ風(fēng)疹=0.949、P風(fēng)疹=0.000;κ巨細(xì)胞=0.910、P巨細(xì)胞=0.000，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法吻合度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且較強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　本研究利用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)，成功開(kāi)發(fā)了三個(gè)定

17、量檢測(cè)試劑，可以應(yīng)用于檢測(cè)人血清中的風(fēng)疹病毒IgG抗體、風(fēng)疹病毒IgM抗體、巨細(xì)胞病毒IgG、巨細(xì)胞病毒IgM抗體共四種不同的血清標(biāo)志物。經(jīng)評(píng)價(jià)，試劑的靈敏度高、準(zhǔn)確度好、檢測(cè)范圍寬、精密度和特異性等各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求;與同類商業(yè)化進(jìn)口試劑比較，其臨床特異性和敏感性均無(wú)顯著差異，達(dá)到了臨床檢測(cè)試劑的要求。特別是雙標(biāo)記風(fēng)疹病毒/巨細(xì)胞病毒IgM抗體檢測(cè)試劑，可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)兩種不同的血清標(biāo)志物，極大地減少了臨床檢測(cè)的工作量，具