EB病毒核抗原(NA1)IgA抗體和Zta蛋白IgA抗體時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的研制.pdf

1、目的：
　　本研究采用時間分辨熒光免疫分析技術(shù)研制EB病毒NA1IgA、Zta IgA檢測試劑，通過評價各項性能指標，并與其他檢測試劑盒進行比較，評價其在臨床檢測應(yīng)用中的可行性。
　　方法:
　?。ㄒ唬〦B病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑
　　1.1 EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的工藝優(yōu)化。
　　1.1.1 采用間接法研制EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑

2、。
　　1.1.2 配置NA1IgA陰性對照品、陽性對照品:陰性對照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒核抗原(NA1) IgA抗體ELISA檢測陰性的正常人血清;陽性對照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒核抗原(NA1) IgA抗體ELISA檢測為陽性的血清。
　　1.1.3 銪標記抗體與純化:將0.5mg抗人IgA抗體加入50KD的蛋白超濾離心柱中，用標記緩沖液重復(fù)洗滌，9000r/min離心，每次6min，共6次。純化抗體后，按質(zhì)量

3、比5∶1的比例加入銪標記配體，標記體系為200μL，將待標記抗體與銪標記試劑充分混勻后置于搖床25℃震蕩過夜，次日過分子篩層析純化，收集洗脫液，1mL/管，逐管測熒光值，合并高值的洗脫液，并用BCA法檢測收集的洗脫液的終濃度，最后加入0.1％濃度的BSA作保護劑，-20℃保存。
　　1.1.4 包被濃度的確定:為確定最佳的NA1抗原的包被濃度，我們選取了0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/m

4、L、3μg/mL、4μg/mL七個不同的包被濃度梯度。在不同的包被濃度下，觀察所選的陰性樣本、陽性樣本及陰性對照和陽性對照的熒光值，以熒光值趨于穩(wěn)定為最佳的包被濃度。
　　1.1.5 銪標稀釋比的確定:用稀釋液將標記抗體分別稀釋成1∶400、1∶600、1∶800、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000七個不同的稀釋比。不同的銪標記抗體稀釋比下，觀察所選陰性樣本、陽性樣本及陰性對照和陽性對照的熒光值變化，在本底較低

5、的情況下，取陽性樣本和陰性樣本的熒光值比值高，區(qū)別比較大的為最佳稀釋比。
　　1.1.6 反應(yīng)時間的確定:在其他反應(yīng)條件確定的前提下，我們分別設(shè)定15min、30min、45min、60min、90min、120min六個反應(yīng)時間，觀察所選樣本及陰性對照和陽性對照熒光值隨著反應(yīng)時間增加所發(fā)生的變化，以熒光值趨于平衡的時間作為體系的最佳反應(yīng)時間。
　　1.2 EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的分析性能評價

6、r>　　1.2.1 精密度實驗:重復(fù)測定三個不同樣本(S1、S2、S3)的熒光值，得到每個樣本的均值、標準差，計算分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)。
　　1.2.2 特異性實驗:巨細胞病毒陽性樣本，單純皰疹病毒Ⅰ型陽性樣本，單純皰疹病毒Ⅱ型陽性樣本，乙型肝炎陽性樣本，丙型肝炎陽性樣本各十例，以自制試劑檢測上述血清，觀察其檢測結(jié)果，評價檢測的交叉反應(yīng)性。
　　1.2.3 抗干擾性分析:陰性對照、陽性對照中加入一定量的甘油三酯、血紅蛋白和

7、膽紅素，對其進行測定，計算平均值。
　　1.3 試劑盒臨床性能評估
　　1.3.1 參考值的確定:以自制的EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析試劑盒檢測420份健康人血清，統(tǒng)計血清熒光值的分布情況，計算樣本熒光值與陰性對照的比值。取涵蓋99％以上正常樣本的界值，初步確定為試劑盒的正常人參考值，再結(jié)合ROC曲線最終確定參考值范圍。
　　1.3.2 與對照試劑盒ELISA的比較試驗:用自制試劑盒和對照試劑盒同時對50

8、9份血清樣本進行檢測，對其陰性符合率和陽性符合率進行比較。
　　（二）髓病毒Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑
　　2.1 EB病毒Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的工藝優(yōu)化。
　　2.1.1 采用間接法研制EB病毒Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑。
　　2.1.2 配置Zta IgA陰性對照品、陽性對照品:陰性對照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒Zta蛋白IgA抗體ELISA檢測陰性的正

9、常人血清;陽性對照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒Zta蛋白IgA抗體ELISA檢測為陽性的血清。
　　2.1.3 銪標記抗體與純化:將0.5mg抗人IgA抗體加入50KD的蛋白超濾離心柱中，用標記緩沖液重復(fù)洗滌，9000r/min離心，每次6min，共6次。純化抗體后，按質(zhì)量比5∶1的比例加入銪標記配體，標記體系為200μL，將待標記抗體與銪標記試劑充分混勻后置于搖床，25℃震蕩過夜，次日過分子篩層析純化，收集洗脫液，1mL/管，逐

10、管測熒光值，合并高值的洗脫液，并用BCA法檢測收集的洗脫液的終濃度，最后加入1‰濃度的BSA作保護劑，-20℃保存。
　　2.1.4 包被濃度的確定:為確定最佳的Zta抗原的包被濃度，我們選取了0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、4μg/mL七個不同的包被濃度梯度。在不同的包被濃度下，觀察所選的陰性樣本、陽性樣本及陰性對照和陽性對照的熒光值，以熒光值趨于穩(wěn)定時選其為最佳的

11、包被濃度。
　　2.1.5 銪標稀釋比的確定:用稀釋液將標記抗體分別稀釋成1∶400、1∶600、1∶800、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000七個不同的稀釋比。不同的銪標記抗體稀釋比下，觀察所選陰性樣本、陽性樣本及陰性對照和陽性對照的熒光值變化，在本底較低的前提下，取陽性樣本熒光值和陰性樣本熒光值比值高，區(qū)別比較大的為最佳稀釋比。
　　2.1.6 反應(yīng)時間的確定:在其他反應(yīng)條件確定的前提下，我們分別設(shè)定

12、30min、45min、60min、90min、120min五個反應(yīng)時間，觀察所選樣本及陰性對照和陽性對照熒光值隨著反應(yīng)時間增加所發(fā)生的變化，以熒光值趨于平衡的時間作為體系的最佳反應(yīng)時間。
　　2.2 EB病毒Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的分析性能評價
　　2.2.1 精密度實驗:重復(fù)測定三個不同樣本(S1、S2、S3)的熒光值，得到每個樣本的均值、標準差，計算分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)。
　　2.2.2 特

13、異性實驗:巨細胞病毒陽性樣本，單純皰疹病毒Ⅰ型陽性樣本，單純皰疹病毒Ⅱ型陽性樣本，乙型肝炎陽性樣本，丙型肝炎陽性樣本各十例，以自制試劑檢測上述血清，觀察測定的陰陽性情況，評價檢測的交叉反應(yīng)性。
　　2.2.3抗干擾性分析:陰性對照、陽性對照中加入一定量的甘油三酯、血紅蛋白和膽紅素，對其進行測定，判斷干擾情況。
　　2.3 試劑盒臨床性能評估
　　2.3.1 參考值范圍:以自制的EB病毒Zta蛋白IgA時間分辨熒光免疫分

14、析試劑盒檢測445份健康人血清，統(tǒng)計血清熒光值的分布情況，計算樣本熒光值與陰性對照的比值。取涵蓋99％正常樣本的界值，初步確定為試劑盒的正常人參考值，再結(jié)合ROC曲線最終確定參考值范圍。
　　2.3.2 與對照試劑盒的比較:樣本用自制試劑盒和對照試劑盒同時對501份樣本進行檢測，對其陰性符合率和陽性符合率進行比較。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬?EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑
　　NA1抗原包被濃度

15、確定為2.5μ g/mL，銪標記抗體稀釋比例為1∶2000，反應(yīng)時間確定為60min。420份健康人血清測試結(jié)果顯示，當(dāng)樣本熒光值與陰性對照比值在2.7時，包含了99％以上的樣本;ROC曲線表明，當(dāng)比值在2.7時，敏感度為97.7％，特異性為95.5％;據(jù)此設(shè)定本試劑盒的EBNA1 IgA抗體的cutoff值=陰性對照熒光值×2.7。分析內(nèi)和分析間精密度分別為1.56-4.99％和3.92-6.95％;與CMV、HSVⅠ型、HSVⅡ型、

16、HBV、HCV無交叉反應(yīng)。干擾性實驗表明自制試劑盒不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。與中山生物公司研制的EB病毒核抗原(NA1) IgA抗體ELISA試劑盒比較，本試劑盒檢測的結(jié)果與中山生物公司的試劑盒檢測結(jié)果高度一致，說明本試劑能夠滿足臨床檢測的要求。
　?。ǘ?EB病毒Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑
　　Zta抗原包被濃度確定為2.0μg/mL，銪標記抗體稀釋比例為1∶1000，反應(yīng)時間確定為60min

17、。445份健康人血清測試結(jié)果顯示，當(dāng)樣本熒光值與陰性對照比值在3.1時，包含了99％以上的樣本;ROC曲線表明，當(dāng)比值在3.1時，敏感度為99.2％，特異性為93.6％;據(jù)此設(shè)定本試劑盒的Zta IgA抗體的cutoff值=陰性對照熒光值×3.1。分析內(nèi)和分析間精密度分別為2.45％-3.69％和3.80％-4.80％;與巨細胞病毒，單純皰疹病毒Ⅰ型，單純皰疹病毒Ⅱ型，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒無交叉反應(yīng)。干擾性實驗表明自制試劑盒不受血

18、紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。與中山生物公司研制的EB病毒Zta蛋白IgA抗體ELISA試劑盒比較，對501份臨床樣本進行分析比較，本試劑盒檢測的結(jié)果與中山生物公司的試劑盒檢測結(jié)果高度一致，說明本試劑能夠滿足臨床檢測的要求。
　　結(jié)論:
　　以上結(jié)果表明，本研究研制的EB病毒核抗原(NA1) IgA、 Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的各項指標（精密度、特異性、干擾性等）均達到臨床檢測試劑要求，有望廣泛應(yīng)用于臨床