萊克多巴胺單克隆抗體免疫檢測(cè)試劑的研制和應(yīng)用.pdf

1、萊克多巴胺（Ractopamine，RCT）是一種β腎上腺素能興奮劑，具有營(yíng)養(yǎng)再分配、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的作用。萊克多巴胺可能被非法作為動(dòng)物飼料添加劑，以提高飼料轉(zhuǎn)化率和增加瘦肉率，但其殘留對(duì)人類健康存在潛在的危害。本研究旨在制備特異性針對(duì)萊克多巴胺的單克隆抗體，并建立競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ciELISA)和免疫膠體金試紙條用于萊克多巴胺殘留的檢測(cè)。
　　 采用混合酸酐法將萊克多巴胺與匙孔藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)

2、，經(jīng)紫外光譜掃描確定偶聯(lián)成功，測(cè)得偶聯(lián)物RCT-KLH濃度為3.6mg/mL，RCT-BSA濃度為6.2mg/mL。以偶聯(lián)物RCT-KLH作為免疫原，免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠，取小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag-14進(jìn)行融合。以RCT-BSA作為包被抗原，經(jīng)間接ELISA篩選出陽(yáng)性細(xì)胞株，再用有限稀釋法進(jìn)行多次亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞10株，分別為1D9、1F3、2Cll、5C3、3A10、4A8、68

3、7、6D5、7Cll、7D3，其中單克隆抗體5C3和3A10間接ELISA效價(jià)均為1:500000。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA顯示，單克隆抗體5C3對(duì)萊克多巴胺的50％阻斷作用濃度(ICso)為3.98ng/mL，對(duì)鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇的IC50均大于2000ng/mL;對(duì)鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率均小于0.2％。
　　 以單克隆抗體5C3為核心試劑，建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)萊克多巴胺的方法，并研制出ELISA試劑盒，以混

4、合酸酐法人工合成的萊克多巴胺-卵清蛋白(RCT-OVA)為包被抗原，萊克多巴胺為競(jìng)爭(zhēng)的半抗原，兩者與一定量的抗萊克多巴胺單克隆抗體5C3在競(jìng)爭(zhēng)體系中反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，包被抗原的最佳稀釋濃度為1:1600，抗萊克多巴胺單克隆抗體5C3工作濃度為1:8000，包被抗原37℃包被3h為最佳包被條件。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)線性范圍為0.5～100ng/mL，最低檢測(cè)限為0.5ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)達(dá)到0.9

5、968。試劑盒的樣品檢測(cè)離散系數(shù)(CV)不高于3.4％，陽(yáng)性添加回收率平均達(dá)到99.2％。對(duì)豬飼料、肝臟、尿液樣品，ELISA試劑盒的檢測(cè)限分別為0.01mg/kg、0.01mg/kg和0.5ng/mL。經(jīng)廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、四川出入境檢驗(yàn)檢疫局、南通市畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心和南京市棲霞區(qū)畜牧獸醫(yī)站等四家單位對(duì)人工添加菜克多巴胺樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示當(dāng)樣品中萊克多巴胺濃度>0.5ng/mL時(shí)，本研究中研制的ELISA檢

6、測(cè)試劑盒與德國(guó)拜法食品安全檢測(cè)和飼料監(jiān)控分析公司生產(chǎn)的萊克多巴胺ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)符合率達(dá)95％以上。
　　 采用混合酸酐法制備的RCT-OVA偶聯(lián)抗原和膠體金標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體5C3，建立了檢測(cè)萊克多巴胺的膠體金免疫層析試驗(yàn)方法，并組裝成標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)卡。該檢測(cè)卡具有較好的敏感性和特異性，最低可檢測(cè)10ng/mL的萊克多巴胺，而與克倫特羅和沙丁胺醇無(wú)交叉反應(yīng)。應(yīng)用該方法對(duì)飼料、組織和尿液樣品中萊克多巴胺的最低檢測(cè)量分

7、別為0.05mg/kg,0.05mg/kg和10ng/mL.經(jīng)廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心、四川出入境檢驗(yàn)檢疫局、南通市畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心和南京市棲霞區(qū)畜牧獸醫(yī)站等四家單位對(duì)人工添加樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示當(dāng)樣品中萊克多巴胺殘留濃度>10ng/mL時(shí)，本研究中研制的膠體金免疫檢測(cè)試紙條與德國(guó)拜法食品安全檢測(cè)和飼料監(jiān)控分析公司生產(chǎn)的萊克多巴胺ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果符合率均為100％;當(dāng)樣品中萊克多巴胺殘留濃度>5ng/ml時(shí)，符合

8、率可達(dá)85％以上。
　　 應(yīng)用萊克多巴胺單克隆抗體免疫檢測(cè)試劑檢測(cè)了不同來(lái)源的樣品。在江蘇檢驗(yàn)檢疫局檢測(cè)豬肉樣品655份，萊克多巴胺ELISA試劑盒與LC-MSMS法對(duì)豬肉樣品檢測(cè)的符合率為100％。在吉林檢驗(yàn)檢疫局檢測(cè)出口豬副產(chǎn)品31批次，萊克多巴胺未檢出。國(guó)家質(zhì)量安全監(jiān)控計(jì)劃部分2008年8-10月份檢測(cè)進(jìn)口凍豬副產(chǎn)品751批和鹽漬腸衣69批，萊克多巴胺不合格率6.95％;2009年8-10月檢測(cè)進(jìn)口豬副產(chǎn)品869批，萊克多