熒光定量PCR方法檢測嬰兒尿液中人類巨細胞病毒基因含量.pdf

1、中國醫(yī)科大學碩士學位論文熒光定量PCR方法檢測嬰兒尿液中人類巨細胞病毒基因含量姓名：何蓉申請學位級別：碩士專業(yè)：兒科學指導教師：劉蘭青20000501實驗方法1DNA提?。翰捎贸Ｒ?guī)堿裂解法。2擴增反應(1)定性PCR擴增引物：Pl5’一TGGGCTAACTATGCAGAGCA一3’P。57一AGCCATTGGTGGTCTTAGGG一37反應體系20肛1，循環(huán)條件：93。C3分鐘；93“C45秒55“C45秒一72℃60秒，循環(huán)35次；7

2、2oClO分鐘。產(chǎn)物進行電泳檢測，于244bp處出現(xiàn)橙黃色條帶者即判為陽性。(2)FQPCR擴增本文應用的FQ—PCR方法是雙標探針水解的熒光定量PCR方法。此方法在普通PCR方法基礎上，添加了一條標記有2個熒光基團的探針。一個熒光基團標記在探針的5r端，稱為熒光報告基團(R)，另一個標記在探針的3’端，稱為熒光抑制基團(Q)。兩者構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即5’端的熒光基團發(fā)出的熒光可被另一熒光基團抑制。探針的3’端羥基已被封閉，不具有延伸能

3、力。探針在無特異性PCR發(fā)生時，熒光信號無變化。當有特異性PCR發(fā)生時，探針會在PCR過程中被Taq酶的5’一37活性作用切斷，抑制作用消失，從而引起報告基團熒光信號的增長。熒光信號伴隨著PCR的進行和PCR產(chǎn)物的增長而增長。FQPCR方法就是利用此原理，在PCR過程中，實時檢測反應體系中的熒光信號的變化。當信號增強到某一閾值時，記錄下此時的循環(huán)數(shù)(Ct值)，該循環(huán)數(shù)和PCR體系中起始DNA量的對數(shù)值之間有嚴格的線形關系，利用陽性標準品