可視化LAMP法快速檢測(cè)牛乳中單增李斯特菌的研究.pdf

1、單增李斯特菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，可引起人畜共患疾病。近年來(lái)由這種菌引起的食品安全事件越來(lái)越多，它的危害也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。但是應(yīng)用于檢測(cè)單增李斯特菌的現(xiàn)有方法存在著很多限制因素，不能滿足快速發(fā)展的食品行業(yè)現(xiàn)實(shí)需求，因此需要開(kāi)發(fā)一種快速、方便的單增李斯特菌檢測(cè)方法。
　　 作為一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)應(yīng)用四條引物識(shí)別靶基因，特異

2、性更好、靈敏度更高、檢測(cè)速度更快，特別適合用于檢測(cè)病源微生物，因此繼續(xù)研究和完善此方法具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 為了簡(jiǎn)化LAMP產(chǎn)物檢測(cè)程序，開(kāi)發(fā)出來(lái)的羅丹明B衍生物可以在擴(kuò)增之前加入到反應(yīng)體系中，陰性（紅色）陽(yáng)性（藍(lán)色）顏色對(duì)比明顯，與2％瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果一致。
　　 為了快速檢測(cè)單增李斯特菌，使用疊氮溴化乙錠(EMA)處理該菌培養(yǎng)液，以李氏溶血素基因（hlyA）為靶基因，羅丹明B衍生物作為反應(yīng)指示劑，通過(guò)優(yōu)化

3、指示劑、鎂離子等濃度，建立了LAMP檢測(cè)體系。25μL LAMP反應(yīng)體系成分:2μLDNA模板;內(nèi)引物各1.6μmol/L（FIP和BIP）;外引物各0.2μmol/L(F3和B3);環(huán)引物各0.8μmol/L(LF和BF);1×Thermopolreaction buffer; BstDNA聚合酶8U;3mmol/L的MgCl2;0.6mol/L的Betaine;1mmol/L的dNTPs;羅丹明B衍生物4.14×10-5g/mL，在

4、65℃分別孵育60min，最后在80℃加熱10min終止反應(yīng)。在人工污染的牛乳中，單增李斯特菌的LAMP檢測(cè)限為1.08×101cfu/mL,其靈敏度是PCR法的10倍，與GB4789.30-2010相比，準(zhǔn)確度為100％。
　　 將液態(tài)LAMP反應(yīng)體系（無(wú)BstDNA聚合酶、無(wú)DNA模板）分為添加羅丹明B衍生物和無(wú)羅丹明B衍生物兩組，放置于室溫下，定期取樣進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，直到取出的樣品不能擴(kuò)增為止;對(duì)于失去擴(kuò)增活性的樣品補(bǔ)加關(guān)鍵

5、組分，探究失活主要因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅丹明B衍生物水溶液狀態(tài)不穩(wěn)定，需要現(xiàn)用現(xiàn)配;無(wú)羅丹明B衍生物的液態(tài)LAMP反應(yīng)體系有效期為8d;失去擴(kuò)增活性的主要限制因素是引物，其次為dNTPs。
　　 將上述兩種LAMP反應(yīng)體系在-20℃預(yù)凍12h，再真空冷凍干燥制成干粉，然后重復(fù)操作，探究干粉LAMP反應(yīng)體系在室溫下的有效期以及失活的主要因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有羅丹明B衍生物的LAMP反應(yīng)體系不能擴(kuò)增，無(wú)羅丹明B衍生物的LAMP反應(yīng)體系可以擴(kuò)增

6、，有效期為30d，失去擴(kuò)增活性的主要限制因素是Thermopol reaction buffer。
　　 為了避免肉眼觀察帶來(lái)的誤差，對(duì)含有羅丹明B衍生物的LAMP反應(yīng)體系加熱不同時(shí)間后，用DU800 Nueleic acid/Protein ANALYZER做波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加熱擴(kuò)增60min，在660nm處，Abs大于0.72的為陽(yáng)性，反之則為陰性。
　　 綜上所述，可視化LAMP法快速檢測(cè)原料乳中單增李斯特菌是可