可視化LAMP法等溫快速檢測病原菌與恒溫紙質(zhì)微流體芯片構建的研究.pdf

1、病原菌的快速檢測和準確鑒定在臨床實驗室檢測，生物戰(zhàn)，食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測中是非常重要的。傳統(tǒng)的細菌鑒定微生物學方法包括選擇性培養(yǎng)，生物化學和血清特性檢測等。這些傳統(tǒng)的方法幾乎完全依賴于使用特定的瓊脂培養(yǎng)基分離和挑選活的病原細菌。在實驗室中最常用的鑒定方法是培養(yǎng)，進而基于微生物的表型和生長培養(yǎng)基進行細菌的鑒定。然而，這些用于細菌分析的培養(yǎng)實驗需要幾天或幾周才能提供準確的結果。
　　事實上，在過去的幾十年里，許多快速的方法被開發(fā)來減少檢

2、測時間。到目前為止，快速的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，側流免疫測定法和聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)等，其檢測時間可以減少到10-24 h和4-6 h，靈敏度可以達到102-106 cfu/ml。然而，這些測試需要成本較高的儀器和熟練的專業(yè)操作人員，進而限制了其廣泛應用，特別是在發(fā)展中國家和地區(qū)。在現(xiàn)場檢測(Po

3、int-of-Care Test，POCT)及基層普及使用中它們不是最優(yōu)的選擇。因此發(fā)展使用一種快速、簡單和高特異性的檢測新技術對于病原微生物的檢測診斷具有重要的臨床意義。
　　核酸的恒溫擴增技術主要特點是核酸擴增從開始到結束都是在一個恒定的溫度下進行。與普通PCR相比，它降低了溫控設備的成本，只需要一個普通的恒溫裝置，同時也減少了反應的步驟和時間。因此在POCT診斷中，核酸恒溫擴增比普通PCR更適合。在當前核酸的等溫擴增方法中，

4、環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)法是一種結果較穩(wěn)定的方法，利用一種Bst DNA聚合酶和特異引物在溫度不變(65℃左右)和較短時間(30-60min)的條件下即可對目的片段進行擴增，并且擁有較高的靈敏性和特異性。此外，它只需要一個恒溫裝置，從而使檢測的費用明顯減少。所以，本課題使用LAMP技術構建一種簡單、快速的病原菌核酸檢測法。
　　早在1990年，Manz

5、A和Widmer團隊首次指出在一塊以平方厘米為單位的小芯片上進行樣品制備、生化反應、結果檢測分析的微流體芯片技術。其擁有高效率、低損耗（包括檢測用時、標本量、試劑量），分析微型化和高通量化等特點，并且通過結合傳感或樣品前處理模塊，為以后的現(xiàn)場檢測帶來了方便。
　　紙質(zhì)材料，有著來源豐富、價格低廉、可循環(huán)、不易變性、易處理、易運送、易化學修飾、以及與生物具有較好的相容性等特點，和現(xiàn)代印刷技術相結合可以制備出集分離、分析和檢測一體的微

6、流體裝置。然而目前市場上的紙質(zhì)微流體芯片主要用來檢測免疫蛋白而在核酸檢測上使用較少。其可能的原因是由于核酸普通PCR擴增需要循環(huán)的變化溫度，因而在紙芯片上操作存在一定難度，限制了它的使用。本課題旨在探索在紙質(zhì)微流體芯片上進行LAMP等溫擴增并對擴增產(chǎn)物進行檢測，提高紙質(zhì)微流體芯片在現(xiàn)場診斷中的使用價值。
　　目的:
　　本項目擬充分整合LAMP技術和紙質(zhì)微流體芯片技術的特色與優(yōu)勢，設計和構建LAMP-紙質(zhì)微流體芯片，基于LA

7、MP法構建一種快速、簡單的病原菌檢測方法，便于現(xiàn)場或野外的早期診斷和早期治療。
　　方法:
　　1.病原微生物及其耐藥基因的可視化LAMP快速檢測的構建。
　　1)以銅綠假單胞菌為首的病原微生物收集，并對亞胺培南耐藥性進行藥敏實驗。
　　2)采用簡易水煮法快速提取DNA。
　　3)針對銅綠假單胞菌的OprL和OprD2基因設計LAMP引物。
　　4)可視化LAMP反應體系的構建。
　　5)可視化

8、LAMP檢測的特異性和靈敏性分析。
　　6)臨床標本的檢測。
　　7)統(tǒng)計學分析OprD2陰性和陽性菌株與亞胺培南的耐藥性之間的差異。
　　2.用于等溫擴增核酸的紙質(zhì)微流體芯片的設計和制作。
　　1)在生物活性紙片上對病原微生物進行LAMP擴增檢測。
　　2)用于等溫擴增核酸的紙質(zhì)微流體芯片的設計。
　　3)選用whatm an＃1濾紙進行紙質(zhì)微流體芯片手工簡易制作。
　　4)使用場發(fā)射掃描電鏡

9、對制作的紙質(zhì)微流體芯片的微觀結構觀察。
　　3.基于鏈霉親和素-生物素化LAMP體系的構建和條件的優(yōu)化。
　　1)基于鏈霉親和素-生物素化LAMP反應體系的構建:根據(jù)生物素和鏈霉親和素的共價偶聯(lián)作用，將生物素化的LAMP產(chǎn)物固定在由納米金標記鏈霉親和素的紙芯片表面。
　　2)利用熒光定量PCR儀對其反應體系中最佳溫度，時間，dNTPs濃度，BstDNA大片段聚合酶濃度，MgSO4濃度，Betaine濃度以及內(nèi)外引物濃度

10、進行選擇和優(yōu)化。
　　3)利用熒光定量PCR儀對基于鏈霉親和素-生物素化LAMP反應的靈敏性和特異性進行分析。
　　4)臨床分離株的檢測。
　　結果:
　　1.成功的簡化了提取病原微生物DNA的操作，縮短了實驗時間。并且成功構建了一個快速、靈敏、簡便的檢測耐亞胺培南銅綠假單胞菌的OprL和OprD2基因的可視化LAMP法。其特異性好，靈敏度(17.41μg/L)比傳統(tǒng)PCR高10倍。以傳統(tǒng)方法（細菌培養(yǎng)，VITE

11、K2系統(tǒng)，瓊脂稀釋法）為金標準，對臨床標本OprL和OprD2基因同時進行可視化LAMP法和常規(guī)PCR法檢測。對OprL基因，可視化LAMP法檢測的靈敏性和特異性都為100％，普通PCR法分別為94.9％和87％。對OprD2基因，可視化LAMP法檢測的靈敏性和特異性分別為75％和737％，普通PCR法分別為70％和73.7％。統(tǒng)計學分析表明，OprD2陽性和OprD2陰性菌株對亞胺培南耐藥菌株具有統(tǒng)計學差異。(P＜0.05)。

12、　　2.以銅綠假單胞菌為例，成功的在紙片上對其核酸DNA進行了LAMP擴增。
　　3.成功的對核酸等溫擴增的紙質(zhì)微流體的設計和簡易的制作。獲得國家的實用新型專利（用于等溫擴增核酸的紙質(zhì)微流體，ZL201420583698.X），國家的發(fā)明專利(一種利用紙質(zhì)微流體進行核酸等溫擴增的方法，201410528335.0)。
　　4.成功的構建了基于鏈霉親和素-生物素化LAMP反應體系，為下一步在微流體芯片上固定和信號放大檢測墊定了

13、扎實的實驗基礎。并對其LAMP反應體系條件進行了優(yōu)化:得到最佳反應擴增的溫度為65℃，反應擴增時間為40min，反應液中MgSO4最佳濃度為6 mM，BstDNA聚合酶濃度為0.32U/μl、dNTPs混合液的工作濃度為1.2mM，b-FIP/BIP內(nèi)引物濃度最佳濃度為1.6μM， F3/B3外引物最佳濃度為0.4μM，Betaine韻最佳濃度為0.6mM。以銅綠假單胞菌為例，基于鏈霉親和素-生物化LAMP法使用熒光定量PCR儀檢測分析

14、，其特異性好，靈敏度(0.402μg/L)比可視化LAMP法高100倍，比普通PCR高1000倍。使用該方法檢測銅綠假單胞菌的臨床分離株，其檢出率與可視化LAMP法相當(14/14，100％)，而常規(guī)PCR法(13/14，93％)。
　　結論:
　　1.可視化LAMP法用于快速檢測病原微生物及其耐藥基因具有檢測時間短、過程簡單、靈敏度和特異性高、反應結果肉眼可辨等特點。本課題以銅綠假單胞菌OprL和OprD2基因為例，成功建

15、立了可視化LAMP檢測技術，使檢測結果的識別更容易。統(tǒng)計學分析顯示在亞胺培南耐藥方面，OprD2陰性菌株具有更高的風險。早期識別OprL和OprD2基因?qū)⒂兄谖覀兏玫貙RPA感染選擇抗生素治療方案，這將降低成本和時間。這種診斷方法更適合用于現(xiàn)場和基層醫(yī)療機構的使用。
　　2.微流體芯片技術是指在一塊以平方厘米為單位的小芯片上進行樣品制備、生化反應、結果檢測分析的技術。其擁有高效率、低損耗（包括檢測用時、標本量、試劑量），分析