大豆莖部病原菌環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測的研究.pdf

1、大豆南方莖潰瘍病菌(Diaporthe phaseolorum var.meridionalis,DPM)、大豆北方莖潰瘍病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora，DPC)和擬莖點種腐病菌(Phomopsislongicolla，PL)均為大豆上重要的莖部病原真菌。其中，大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌為我國公布的植物檢疫性病原真菌，在歐洲和北美洲的國家廣泛分布，嚴重影響大豆的生長和產量。大豆擬

2、莖點種腐病菌是影響大豆生長的重要病原菌，每年對我國的大豆生產造成嚴重損失。對于三種病原菌的檢測工作，當務之急就是一方面加強大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的口岸檢疫，防止病原菌的入侵，另一方面要提高對大豆擬莖點種腐病菌的早期快速診斷技術水平，在病菌侵染初期準確診斷出病原菌的存在，降低經(jīng)濟損失。
　　傳統(tǒng)的以傳統(tǒng)的以ITS（內轉錄間隔區(qū)）為靶序列的分子檢測無法快速準確區(qū)分大豆北方莖潰瘍病菌、大豆南方莖潰瘍病菌和大豆擬莖點種腐病

3、菌等近似種。筆者在大豆北方莖潰瘍病菌靶標序列篩選中，發(fā)現(xiàn)了翻譯延伸因子(translation elongationfactor1α，tef1α)序列。翻譯延伸因子是信使核糖核酸翻譯促進多肽鏈延伸的蛋白質因子，其在原核、真核生物中均有存在，具有高度的特異性，常常被用于多種病原菌的分類鑒定上。通過目標病原菌與其相似種比對發(fā)現(xiàn)，三種病原菌在tef1α序列上都有很好的特異性，適合作為分子檢測的靶標?；诃h(huán)介導等溫擴增技術(loop-media

4、tedisothermal amplification，LAMP)，以tef1α為靶序列，針對三種病原物分別設計LAMP特異性引物，建立了基于顏色判定的簡單、快速和靈敏的檢測方法，在特異性的基礎上分別進行了靈敏度驗證、人工接種大豆植株檢測試驗和實際樣本檢測試驗。
　　在大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的LAMP檢測中，64℃等溫條件下進行核酸擴增反應60 min，反應結束后，加入SYBR greenⅠ染料，根據(jù)染料顏色變化判

5、定擴增結果。引物特異性驗證試驗中，只有目標菌株中擴增到梯形條帶，同時加入SYBR greenⅠ染料后可觀察到綠色熒光的陽性反應;而在其他供試菌株中均沒有出現(xiàn)梯形條帶，加入SYBR greenⅠ染料后則保持橙色的陰性反應。該技術在大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的最低檢測限為10pg·μL-1和1pg·μL-1目標菌純DNA。在對分別人工接種了大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌病菌的大豆植株發(fā)病組織的檢測中，DPM-LAMP和D

6、PC-LAMP技術能夠檢測出所有人工接種發(fā)病大豆植株中的目標菌。筆者又對口岸截獲的大豆病殘體進行了人工添加子囊孢子的試驗，DPM-LAMP和DPC-LAMP技術能夠分別在10g進口大豆夾帶的大豆植株殘體中最低檢測出大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的50個子囊孢子和10個子囊孢子。結果顯示，該方法的建立為大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的檢疫以及其所致病害的快速診斷提供了新的技術。
　　在擬莖點種腐病菌的PL-LAMP檢

7、測中，在擴增反應前加入染料HNB（羥基萘酚藍），作為反應指示劑，根據(jù)HNB的顏色變化判定反應結果，引物特異性驗證試驗中，54株分離自不同省份的擬莖點種腐病菌菌株能觀察到天藍色的陽性反應，而從其他真菌和疫霉中反應管保持紫色的陰性反應。在靈敏度檢測中，PL-LAMP技術最低檢測限為100pg·μL-1目標菌純DNA。在對人工接種了大豆擬莖點種腐病菌的大豆植株發(fā)病組織的檢測中，PL-LAMP技術能夠檢測出所有人工接種發(fā)病豆苗中的目標菌。在田間

8、應用方面，對來自江蘇、安徽和武漢的疑似發(fā)病的大豆樣本進行檢測。LAMP檢測技術的陽性率為58/116(50.0％)、利用傳統(tǒng)的病原分離法進行分離的陽性率為36/116(31.0％)，結果顯示，PL-LAMP技術明顯的提高了檢測效率。
　　高通量檢測是目前病原菌檢測技術的發(fā)展方向，發(fā)展高通量的檢測技術對于基層實驗室和出入境口岸檢疫具有重要的意義。對本論文關于我國口岸的兩種植物檢疫性病原物:大豆北方莖潰瘍病菌（D.phaseoloru

9、m var.caulivora）、大豆南方莖潰瘍病菌（D.phaseolorum var.meridionalis）的LAMP檢測技術進行改良優(yōu)化，連同南京農業(yè)大學吳旭東關于大豆莖褐腐病菌（Phialophora gregata f.sp.sojae）的LAMP檢測技術，結合八連排反應管建立了一種能夠同時檢測一個樣本中3種病原菌的高通量檢測體系。在水浴鍋內64℃擴增70min，加入染料HNB（羥基萘酚藍），作為反應指示劑，根據(jù)HNB的顏

10、色變化判定反應結果，如果存在目標菌，反應管顏色變?yōu)樘焖{色，如果不合目標菌，反應液為紫色。應用該檢測體系，對口岸截獲來自3個不同國家的進口大豆殘體進行帶菌檢測，結果顯示，9份樣品中檢測到了2份樣品含有大豆北方莖潰瘍病菌，1份樣品中含有大豆莖褐腐病菌。本研究建立的高通量檢測體系，具有快速、不需要特殊儀器和肉眼判斷結果的優(yōu)勢，適合基層單位的實驗室和檢驗檢疫機構開展分子檢測和病害診斷。
　　綜上所述，本研究在國內外首次采用環(huán)介導等溫擴增技