重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)煙曲霉菌.pdf

1、目的：以煙曲霉內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITSD)為靶序列，篩選煙曲霉菌特異性的引物對(duì)，應(yīng)用重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增(RPA)技術(shù)建立快速檢測(cè)煙曲霉的新方法并對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)優(yōu)化。
　　方法：
　　(1)以煙曲霉菌的易變區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)為靶序列，先用Primer-5軟件在不同區(qū)間設(shè)計(jì)三條上游引物和三條下游引物，交叉配對(duì)組成不同引物對(duì)，然后將引物逐一進(jìn)行Primer-blast，篩選煙曲霉的特異性引物。
　　(2)應(yīng)用機(jī)械性玻璃

2、珠打擊裂解法抽提獲得煙曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA。
　　(3)通過(guò)優(yōu)化RPA檢測(cè)煙曲霉的引物長(zhǎng)度、產(chǎn)物長(zhǎng)度、擴(kuò)增時(shí)間及擴(kuò)增溫度等檢測(cè)條件，建立檢測(cè)煙曲霉的新方法。
　　(4)通過(guò)交叉擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)不同濃度煙曲霉DNA樣品來(lái)評(píng)估RPA檢測(cè)煙曲霉菌的敏感性和特異性。
　　(5)通過(guò)對(duì)21株臨床分離的人致病性曲霉菌菌株的檢測(cè)來(lái)評(píng)估RPA技術(shù)的臨床檢測(cè)性能。
　　(6)通過(guò)RPA與PCR同時(shí)進(jìn)行敏感性、特異性、臨床分離曲霉菌檢

3、測(cè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)RPA與PCR技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)比較。
　　結(jié)果：
　　(1)篩選得到煙曲霉特異性的引物為上游位于ITSD1、下游位于ITSD2、擴(kuò)增產(chǎn)物為489bp的引物。引物序列為:上游引物:5'-GGTCCAACCTCCCACCCGTGTCTATC-3'，下游引物:5'-TTAGAAAAATAAAGTTGGGTGTCGGC-3'
　　(2)通過(guò)機(jī)械性玻璃珠打擊裂解法抽提獲得的煙曲霉基因組DNA在純度和的量上能夠滿足核酸擴(kuò)增

4、需要，且簡(jiǎn)便、快速。
　　(3) RPA技術(shù)檢測(cè)煙曲霉菌的優(yōu)化反應(yīng)條件為:引物長(zhǎng)度范圍為18-32bp;擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍為200-700bp;擴(kuò)增溫度為37-42℃;擴(kuò)增時(shí)間為15-40min。
　　(4) RPA特異性和敏感性:不同曲霉菌種交叉擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)顯示，RPA只在煙曲霉菌擴(kuò)增中有明顯的特異性條帶，而對(duì)黃曲霉、土曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、中國(guó)紅酵母均無(wú)擴(kuò)增。在以瓊脂糖凝膠電泳為檢測(cè)平臺(tái)時(shí)，RPA可以檢測(cè)到最低濃度為100p

5、g/μl的煙曲霉DNA樣品。
　　(5)21株臨床分離的人致病性曲霉菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，RPA對(duì)18株煙曲霉分離菌株的擴(kuò)增均為陽(yáng)性，而3株黃曲霉擴(kuò)增均為陰性。
　　(6)通過(guò)對(duì)RPA和PCR檢測(cè)煙曲霉方法學(xué)的比較，RPA和PCR一樣具有很高的敏感性和很強(qiáng)的特異性。
　　結(jié)論：本研究通過(guò)Primer-Blast篩選針對(duì)煙曲霉ITS1-ITS2靶DNA序列的特異性引物。在優(yōu)化反應(yīng)條件下，應(yīng)用此特異性引物建立的RPA檢測(cè)煙曲霉方法