基于工具酶信號(hào)放大的核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)新方法研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)得到迅速發(fā)展。PCR技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)之一。但是，該技術(shù)對(duì)溫度條件依賴，需要復(fù)雜的變溫設(shè)備，以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境苛刻，難以滿足人們對(duì)簡(jiǎn)便、快速、易操作的分析技術(shù)的需求。結(jié)合高效工具酶建立起來(lái)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)彌補(bǔ)了這些不足，在現(xiàn)場(chǎng)分析和應(yīng)急事件中表現(xiàn)出來(lái)的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越明顯。
　　本論文中構(gòu)建了兩種基于工具酶的等溫核酸檢測(cè)新方法。在第二章中結(jié)合分子信標(biāo)構(gòu)建了一種反應(yīng)快速，體系簡(jiǎn)便的用于m

2、icroRNA檢測(cè)的方法，并且以microRNA Let-7a為靶標(biāo)對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。該方法通過(guò)帶有酶切位點(diǎn)的分子信標(biāo)，在兩種工具酶的作用下利用鏈置換原理實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)信號(hào)的兩重循環(huán)放大。利用此方法對(duì)不同濃度的Let-7a靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，在濃度范圍10zmol-1 fmol，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為8.5×10-15M，并且對(duì)人腦全RNA檢測(cè)中表現(xiàn)出較好的實(shí)用性。
　　針對(duì)目前大部分生物體內(nèi)核酸是以DNA雙鏈形式存在的情況，在

3、第三章中從設(shè)計(jì)的三個(gè)方案中優(yōu)選一種單引物核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)雙鏈DNA方法。此方法首先借助切刻內(nèi)切酶對(duì)雙鏈DNA特異識(shí)別產(chǎn)生切口，利用具有鏈置換活性的聚合酶將雙鏈DNA線性轉(zhuǎn)換成單鏈DNA靶標(biāo)，以擴(kuò)增的單鏈靶標(biāo)為模板設(shè)計(jì)單引物進(jìn)行三重?zé)晒庑盘?hào)的實(shí)時(shí)放大反應(yīng)。此方法以PBS質(zhì)粒DNA對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，實(shí)現(xiàn)了1.0×10-13 M的靶標(biāo)的靈敏檢測(cè)。此方法中只需設(shè)計(jì)一條引物分子，方法體系簡(jiǎn)單，反應(yīng)快速，以期能很好的應(yīng)用于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)