基于切刻酶的等溫核酸擴(kuò)增的研究熵檢驅(qū)測(cè)動(dòng)新分技子術(shù)開的關(guān)研和究信號(hào)放大.pdf

1、核酸作為重要的遺傳信息生物分子，其檢測(cè)被廣泛的應(yīng)用在食品安全、生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是目前應(yīng)用最廣泛的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法之一，然而PCR技術(shù)需要專門的熱循環(huán)儀，限制了其在疾病的即時(shí)診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，發(fā)展更靈敏、快速的核酸等溫檢測(cè)方法具有重要意義。本文構(gòu)建了幾種簡(jiǎn)單、快速的核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)新方法，分別對(duì)DNA和RNA進(jìn)行了快速、靈敏和特異地檢測(cè)。
　　本研究建立了一種基于雙切口分子信標(biāo)的等溫?cái)U(kuò)

2、增檢測(cè)DNA新方法的研究。用該方法對(duì)提取的大腸桿菌16S rDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，當(dāng)檢測(cè)靶標(biāo)的量在100fmol到10amol之間時(shí)呈良好的線性，最低檢測(cè)限為10amol；通過在引物上設(shè)計(jì)突變堿基進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了該方法具有較強(qiáng)的特異性；并用該方法在復(fù)雜體系中檢測(cè)時(shí)呈現(xiàn)較強(qiáng)的抗干擾能力。此外，它是一鍋式的等溫鏈置換擴(kuò)增方法，不需要額外的操作步驟，極大的簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，并降低了樣品污染的可能性。它的這些優(yōu)點(diǎn)使該方法在核酸的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及即

3、時(shí)檢測(cè)（POCT）中更具有實(shí)用性。目前的RNA檢測(cè)方法中，大部分都需要利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后再進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。構(gòu)建了三種無需加反轉(zhuǎn)錄酶可直接等溫?cái)U(kuò)增RNA的實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)現(xiàn)了對(duì)RNA的快速“一步法”檢測(cè)。這幾種方法都利用了本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的Bst DNA聚合酶既具有DNA聚合酶活性又具有內(nèi)在的反轉(zhuǎn)錄酶活性的特點(diǎn)；此外，還充分的利用了DNA聚合酶的鏈置換活性及與切刻酶聯(lián)用的擴(kuò)增放大機(jī)理，最終實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的多重放大。最優(yōu)方法對(duì)大腸桿菌