基于納米金和酶切信號放大的生物傳感分析方法及應(yīng)用研究.pdf

1、隨著分析科學(xué)的不斷發(fā)展，生命科學(xué)領(lǐng)域中的各種分析和檢測過程越來越多地需要要借助于生物傳感技術(shù)獲取所需的信息。生物傳感器具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在復(fù)雜體系中進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，在化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品、醫(yī)藥和軍事等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。理想的生物傳感器對目標(biāo)物應(yīng)該具有非常高的檢測靈敏度(低檢測限)，高特異性(低干擾)，寬的動力學(xué)檢測范圍，快速響應(yīng)時間，以及通用性等特點(diǎn)。
　　 功能核酸是基于體外篩

2、選或指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化法(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)，篩選得到的與生物小分子、蛋白質(zhì)分子、細(xì)胞、金屬離子等高親和力和高特異性結(jié)合的DNA或RNA片段。功能核酸通常包括兩大類具有特殊功能的核酸分子：一類具有類似于蛋白酶的催化活性，稱為DNA酶(DNAzymes)，另一類能夠像抗體一樣特異性結(jié)合目標(biāo)分子，稱為核酸適配體(Aptamer)。功

3、能核酸的發(fā)現(xiàn)突破了傳統(tǒng)意義上關(guān)于核酸只是遺傳信息存儲和轉(zhuǎn)運(yùn)載體的認(rèn)識，為構(gòu)建用于各種分析對象的生物傳感體系提供了全新的設(shè)計思路和平臺。
　　 靈敏度是衡量生物傳感器性能的最重要參數(shù)之一，而單純利用功能核酸結(jié)合目標(biāo)物前后構(gòu)象變化引起信號的改變，在進(jìn)一步提高靈敏度方面已經(jīng)十分有限。近年來，設(shè)計新的信號放大方法用于目標(biāo)物的高靈敏檢測已經(jīng)引起了研究人員的廣泛關(guān)注。提高傳感器靈敏度的方法通常有兩種，一種是降低檢測背景，另外一種是采用信號放

4、大技術(shù)。其中，由于信號放大技術(shù)在提高靈敏度方面的顯著效果，近年來受到了研究者更為廣泛的關(guān)注。
　　 基于以上考慮，綜合文獻(xiàn)報道，本文主要利用信號放大技術(shù)在提高生物傳感器的檢測靈敏度方面做了一些工作，主要內(nèi)容如下：
　　 (1)基于納米金信號放大技術(shù)的生物傳感器的研究。利用納米金比表面積大、具有良好生物相容性以及表面核酸高負(fù)載量的特點(diǎn)，在第2章提出了一種基于“T-Hg2+-T”特異性強(qiáng)結(jié)合作用和納米金信號放大的新型非標(biāo)記H

5、g2+電化學(xué)傳感器。在Hg2＋存在的條件下，連接DNA與電極表面的捕獲探針通過“T-Hg2+-T”相互雜交，然后引入納米金功能化的信號DNA與連接DNA另外一端序列雜交。以亞甲基藍(lán)作為電活性物質(zhì)，由于納米金功能化信號DNA的引入能夠放大檢測信號，因此當(dāng)進(jìn)行DPV檢測時，可得到明顯增強(qiáng)的電化學(xué)信號。該方法可獲得0.5 nM的檢測限，且選擇性好、操作簡單，并可用于實(shí)際樣品的檢測。在第3章，我們基于利用距離決定電磁場(EM)增強(qiáng)作用的指數(shù)減弱

6、，即拉曼標(biāo)記物離納米粒子表面越近，Raman信號越強(qiáng)的原理，發(fā)展了一種基于樹枝狀納米分子結(jié)信號放大技術(shù)的新型SERS傳感器。以基于GR-5 DNA酶的Pb2+SERS傳感器和基于核酸適配體的腺苷SERS傳感器作為分析模型，驗(yàn)證了通過層層自組裝形成納米分子實(shí)現(xiàn)拉曼信號放大的可行性，以及該設(shè)計策略的通用性。為了構(gòu)建Pb2+SERS傳感器，首先將巰基標(biāo)記的GR-5 DNA酶組裝在金電極表面，當(dāng)Pb2+存在時，能夠催化鑲嵌在該DNA酶底物鏈中R

7、NA堿基的水解，使其被剪切為兩部分。金電極表面剩余的核酸片段部分可以和納米金標(biāo)記的報告探針鏈雜交，通過層層自組裝，納米金之間形成了納米結(jié)，拉曼信號得到顯著增強(qiáng)，對Pb2+檢測限可達(dá)0.1 nM。為了檢測腺苷，采用目標(biāo)導(dǎo)致鏈置換構(gòu)建核酸適配體SERS傳感器。核酸適配體首先與金電極表面的捕獲探針互補(bǔ)雜交被固定在電極表面，當(dāng)腺苷存在時，與核酸適配體發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)型發(fā)生變化，從電極表面脫落。然后，捕獲探針可以和納米金標(biāo)記的報告探針鏈雜

8、交，同樣通過層層自組裝形成納米結(jié)，從而導(dǎo)致拉曼信號的顯著增強(qiáng)。該傳感器具有較好的選擇性，檢測下限為50 nM。
　　 (2)基于酶切循環(huán)信號放大技術(shù)的生物傳感器的研究?；诤怂崆锌诿改軌蜃R別特異性的雙鏈序列而只酶切其中一條單鏈從而可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)信號放大的特點(diǎn)，在第4章利用分子信標(biāo)低背景、高靈敏的優(yōu)點(diǎn)提出了一種新型、能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)誘導(dǎo)酶切循環(huán)信號放大過程的“Y型”探針用于高靈敏檢測目標(biāo)DNA，該探針同時具有較強(qiáng)的單堿基錯配識別能力。當(dāng)

9、目標(biāo)DNA存在時，可以和輔助探針協(xié)同打開分子信標(biāo)的發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，三者相互雜交形成“Y型”結(jié)構(gòu)，從而形成了切口酶Nt.BbvCI的識別序列。分子信標(biāo)被核酸切口酶識別切斷后，從傳感系統(tǒng)上游離釋放出來。釋放出的輔助探針和目標(biāo)DNA可以繼續(xù)和另外一個分子信標(biāo)進(jìn)行雜交，同時誘發(fā)第二次酶切循環(huán)。經(jīng)多次酶切循環(huán)反應(yīng)后，實(shí)現(xiàn)了真正的目標(biāo)DNA誘發(fā)酶切循環(huán)信號放大，與第一代基于中間標(biāo)記的直線型信號探針構(gòu)建的“Y型”探針相比更加靈敏，檢測下限為5 pM。在第

10、5章，我們采用將分子識別和信號報告基團(tuán)進(jìn)行分離的設(shè)計策略，避免了對DNA酶進(jìn)行修飾，并采用酶切循環(huán)信號放大技術(shù)構(gòu)建了一種新型熒光催化信標(biāo)，顯著提高了對目標(biāo)物的檢測靈敏度。以L-組氨酸作為分析模型，采用DNA酶鏈和底物鏈以聚T連接的一體化DNA酶作為識別基團(tuán)，L-組氨酸導(dǎo)致底物鏈酶切后的產(chǎn)物序列能夠與作為信號報告基團(tuán)的分子信標(biāo)雜交，進(jìn)一步采用核酸切口酶實(shí)現(xiàn)酶切循環(huán)信號放大，實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物的高靈敏和特異性檢測，檢測限為200 nM。由于DN

11、A酶具有可以循環(huán)剪切的性質(zhì)，也可以用于酶切信號放大技術(shù)。在第6章，我們利用連接反應(yīng)觸發(fā)DNA酶和催化分子信標(biāo)信號放大技術(shù)，提出了一種零背景、高靈敏的小分子檢測方法。以ATP和NAD+作為分析模型，利用DNA連接酶對生物小分子的高特異性依賴，以連接反應(yīng)觸發(fā)劈開DNA酶的激活，然后與設(shè)計為分子信標(biāo)的底物鏈雜交，在Zn2+存在的條件下進(jìn)行DNA酶的酶切循環(huán)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對生物小分子高靈敏、高特異性的熒光檢測，其靈敏度和特異性均優(yōu)于以前所報道的傳

12、感器。
　　 (3)基于納米金和酶切循環(huán)雙信號放大的生物傳感器的研究?；诤怂嵬馇忻负图{米金雙重信號放大策略，在第7章提出了一種非標(biāo)型、高靈敏、高特異性電化學(xué)DNA傳感器。該傳感器首先在均相中進(jìn)行發(fā)夾型探針和目標(biāo)DNA之間的雜交及酶切反應(yīng)，避免了電極表面進(jìn)行酶切所遇到的酶效率降低等缺點(diǎn)，而且該發(fā)夾型探針能夠提供較好的堿基錯配識別能力；然后將酶切產(chǎn)物序列與電極表面的發(fā)夾型捕獲探針雜交，進(jìn)一步提高了堿基錯配識別能力；最后利用納米金功