基于納米金和滾環(huán)放大的生化分析新方法研究.pdf

1、湖南大學(xué)博士學(xué)位論文基于納米金和滾環(huán)放大的生化分析新方法研究姓名：張松柏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：分析化學(xué)指導(dǎo)教師：沈國(guó)勵(lì)俞汝勤20090601幕f納米會(huì)和滾環(huán)放人的生化分析新方法研究苯二胺的電聚合膜，為傳感界面的構(gòu)建提供了一個(gè)富含氨基的穩(wěn)固基底。用戊二醛作為交聯(lián)劑，將胱胺偶合在修飾電極表面后，金納米顆粒通過(guò)自組裝修飾到所得電極表面。利用金納米顆粒的獨(dú)特性質(zhì)，抗體可以通過(guò)氨基金的親和力固定到納米會(huì)粒子上，并具有高的負(fù)載量和高的免疫活性。引

2、入模型分析物后，二茂鐵標(biāo)記的抗體通過(guò)抗體抗原的特異反應(yīng)結(jié)合到傳感界面上，產(chǎn)生氧化還原信號(hào)，峰值與分析物的量成比例關(guān)系。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，我們提出的檢測(cè)方法其檢測(cè)下限可低至10pg／ml，實(shí)現(xiàn)了對(duì)免疫物質(zhì)的高靈敏檢測(cè)。隨后，我們還將金納米顆粒應(yīng)用于核酸和小分子的檢測(cè)，希望實(shí)現(xiàn)高靈敏和快速檢測(cè)的目的。在第4章，提出了一種基于納米金熒光淬滅的一步均相DNA雜交檢測(cè)的新方法。納米金顆粒表面修飾有5’端硫基修飾的寡核苷酸鏈(納米顆粒探針序列)，

3、該核苷酸鏈3’端標(biāo)記著帶負(fù)電荷的熒光染料分子FAM。FAM標(biāo)記的探針序列與同帶負(fù)電荷的納米金顆粒之間的靜電相斥作用使得納米顆粒探針序列保持伸展?fàn)顟B(tài)。體系中加入互補(bǔ)的目標(biāo)序列與探針序列雜交使得探針序列從原柬的伸展型轉(zhuǎn)換成拱狀型，從而使熒光基團(tuán)與納米金顆?？拷?。結(jié)果熒光被納米金顆粒有效地淬滅，熒光淬滅效率與目標(biāo)序列的濃度相關(guān)，由此可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中的目標(biāo)序列的定量檢測(cè)?；诮鸺{米顆粒受表面電荷等周?chē)h(huán)境因素影響容易團(tuán)聚的原理，在第5章發(fā)展了一種

4、新型非標(biāo)記的過(guò)氧化氫比色檢測(cè)系統(tǒng)。將H202加入鄰苯二胺(OPDA)／辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的溶液中。反應(yīng)充分后再加入納米金溶液，混合溶液顏色由紅色快速地變?yōu)樗{(lán)色，且在420nm處有明顯的吸收峰。這是由于在辣根過(guò)氧化物酶的催化下，鄰苯二胺被過(guò)氧化氫氧化，生成偶氮苯，進(jìn)而引發(fā)納米金顆粒的團(tuán)聚。納米合的團(tuán)聚程度與420nm處吸收峰的強(qiáng)度均隨H202濃度增加而增大。用這種方法檢測(cè)H202，用肉眼直接半定量分析其檢測(cè)下限為10M，用紫外可見(jiàn)吸

5、附光譜法定量檢測(cè)，檢測(cè)下限可達(dá)06M。該法簡(jiǎn)便有效，同樣適用于其他物質(zhì)的檢測(cè)，如葡萄糖，膽固醇等等，為新型生化檢測(cè)系統(tǒng)的研制提供了新思路。(2)基于滾環(huán)放大的生化分析方法研究。利用連接滾環(huán)放大反應(yīng)系統(tǒng)可在恒溫下獲得大量與環(huán)形模板互補(bǔ)的重復(fù)序列這一特點(diǎn)，在第6章提出了一種基于連接滾環(huán)擴(kuò)大和嵌入亞甲基藍(lán)的非標(biāo)記、高靈敏的單核苷多態(tài)性檢測(cè)方法。通過(guò)連接酶識(shí)別目標(biāo)DNA上的點(diǎn)突變而產(chǎn)生的環(huán)形模板，在恒溫下可以通過(guò)Phi29DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，