蛋白糖基化分析新方法研究.pdf

1、糖基化是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)譯后修飾方式之一，連接在天冬酰胺上的稱(chēng)為N-糖鏈，連接在絲氨酸或者蘇氨酸上的稱(chēng)為O-糖鏈。蛋白糖基化在許多生命活動(dòng)中起重要作用，包括蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞識(shí)別、癌細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)等。蛋白N糖基化分析有很多方法。最簡(jiǎn)單的方法是酶解釋放N糖鏈后直接進(jìn)行MS質(zhì)譜分析。Peptide-N-glycosidase F(PNGase F)是一種用來(lái)從蛋白或多肽上酶解沒(méi)有取代的或6位巖藻糖取代的N糖鏈的酶，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于哺乳

2、動(dòng)物的N糖基化研究中。一些進(jìn)一步的研究就建立在這些釋放下來(lái)的N糖鏈上。更常見(jiàn)的情況下，是將N糖鏈釋放后進(jìn)行衍生化以改善其分離度和增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度。
　　本研究建立了一種新的 N糖基化的分析方法，其中優(yōu)化了去糖基化的反應(yīng)條件和試劑，以加快 N糖鏈的釋放速度，并采用了一種能夠同時(shí)提高分離度和熒光、質(zhì)譜響應(yīng)靈敏度的新型標(biāo)記試劑（Rap iF luor-MS）來(lái)標(biāo)記釋放下來(lái)的糖鏈。此外，為了簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)分析難度，我們還建立了一個(gè)虛擬的N糖鏈數(shù)據(jù)

3、庫(kù)，使得復(fù)雜的N糖鏈數(shù)據(jù)能夠被自動(dòng)、精確有效地識(shí)別和歸屬。最終形成一套簡(jiǎn)單、快速、靈敏、高效的N糖基化分析方法，并將其成功應(yīng)用到了復(fù)雜糖蛋白和癌細(xì)胞表面N糖基化分析中。另外，由于目前沒(méi)有廣譜O-糖基解離酶，我們初步建立了一種有效的O-糖鏈分析方法。該方法采用了高能碰撞解離產(chǎn)物離子相關(guān)電子轉(zhuǎn)移解離（HCD-pd-ETD）二級(jí)質(zhì)譜模式對(duì)廣譜蛋白酶降解得到的糖肽進(jìn)行分析，并對(duì)數(shù)據(jù)采用較新的 Byo nic軟件進(jìn)行了分析，這種方法可以同時(shí)得到