骨唾液酸蛋白糖基化修飾對(duì)成骨的影響.pdf

1、目的：
　　 探討骨唾液酸蛋白(Bone Sialoprotein，BSP)糖基化修飾對(duì)成骨的影響及可能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.建立MC3T3-E1 Subclone14成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，RT-PCR和Western-Blot檢測(cè)成骨細(xì)胞相關(guān)因子骨鈣素、骨唾液酸蛋白等mRNA和蛋白水平的表達(dá)，堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、von Kossa染

2、色以鑒定成骨細(xì)胞和骨礦化的形成。
　　 2.在成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型中加入人重組骨唾液酸蛋白(Recombinant Human BoneSialoprotein，rhBSP)及經(jīng)O-糖苷酶消化的去O-糖基化rhBSP，使用熒光標(biāo)記的具有特異識(shí)別O糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素VVL，VVA(Biotinylated Vicia Villosa Lectin，VVL，VVA)檢測(cè)細(xì)胞中O糖鏈，并通過(guò)流式細(xì)胞儀驗(yàn)證；同時(shí)選擇在成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型中高表達(dá)

3、ppGalNAcT1和T4(polypeptide GalNAc transferases，ppGalNAcTs)為研究對(duì)象，利用RNA干擾技術(shù)，分別構(gòu)建和篩選出高效的T1siRNA和T4siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入MC3T3-E1 Subclone14成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型中，ALP、von Kossa染色及RT-PCR、Western-blot等成骨細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)手段觀察BSP O-糖基化修飾對(duì)成骨的影響。
　　 3.在成骨細(xì)胞培養(yǎng)模

4、型中加入不同濃度的α2，3神經(jīng)氨酸苷酶，使用熒光標(biāo)記的具有特異識(shí)別α2，3唾液酸結(jié)構(gòu)的凝集素MALⅡ(Maackia amurensisleukoagglutininⅡ，MALⅡ)檢測(cè)細(xì)胞表面的α2，3唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)，并通過(guò)流式細(xì)胞儀驗(yàn)證；Western-blot檢測(cè)BSP蛋白水平的變化；同時(shí)利用ALP、von Kossa染色及RT-PCR、Western-blot等成骨細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)手段觀察BSP相關(guān)的末端唾液酸化對(duì)成骨的影響。

5、>　　 4.在成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型中加入rhBSP、肽N-糖苷酶F消化的去N-糖基化rhBSP及不同濃度的衣霉素(N-糖基化糖鏈合成抑制劑)，使用熒光標(biāo)記的具有特異識(shí)別N糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素LEA(Lycopersicon esculentum agglutinin，LEA)檢測(cè)細(xì)胞中N糖鏈，并通過(guò)流式細(xì)胞儀驗(yàn)證；同時(shí)利用ALP、von Kossa染色及：RT-PCR、Western-blot等成骨細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)手段觀察BSPN-糖基化修飾對(duì)

6、成骨的影響。
　　 5.在MC3T3-E1 Subclone14成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型中，加入肽N-糖苷酶F、O-糖苷酶、唾液酸酶、β-半乳糖苷酶和氨基葡糖苷酶等，Western-blot檢測(cè)BSP蛋白水平的變化，同時(shí)利用凝集素標(biāo)記、流式細(xì)胞儀鑒定、質(zhì)譜分析等方法，探討B(tài)SP的糖鏈結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功建立了MC3T3-E1 Subclone14成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型，證明MC3T3-E1Subclone142

7、胞培養(yǎng)至10d左右ALP染色呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，即成骨細(xì)胞大量形成，von Kossa染色至14d左右呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明成骨細(xì)胞分泌的骨基質(zhì)進(jìn)入礦化期。
　　 2.在成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型中加入rhBSP及O-糖苷酶消化的去O-糖基化rhBSP，ALP、von Kossa染色結(jié)果顯示：BSP O-糖基化修飾影響了成骨細(xì)胞和骨礦化的形成；同時(shí)成功構(gòu)建和篩選出在MC3T3-E1 Subclone14成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型中高表達(dá)的高效siRNA表達(dá)載

8、體ppGalNAcT1-1545和ppGalNAcT4-784，轉(zhuǎn)染入成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型后有效抑制了成骨細(xì)胞分化和骨礦化的形成，證實(shí)BSP O-糖基化修飾影響成骨主要為ppGalNAcT1、T4兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶。
　　 3.BSP相關(guān)的末端唾液酸化對(duì)骨礦化的影響主要以α2，3唾液酸為主，它可能通過(guò)影響維生素D受體VDR的表達(dá)，從而影響骨的礦化，但對(duì)成骨細(xì)胞的分化無(wú)明顯影響。
　　 4.在成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型中加入rhBSP、肽N

9、-糖苷酶F消化的去N-糖基化rhBSP及不同濃度的衣霉素，ALP、von Kossa染色等結(jié)果顯示：BSP N-糖基化修飾及N-糖基化糖鏈合成抑制劑衣霉素對(duì)成骨無(wú)明顯影響。
　　 5.肽N-糖苷酶F釋放糖蛋白中N-連接的糖鏈；質(zhì)譜檢查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)唾液酸酶處理后的BSP，其N-糖鏈木端的唾液酸脫落，1142(H5N4F1)、1366(H6N5F1)、1279(H6N5)、1504(H7N6)等出現(xiàn)在唾液酸酶處理后的圖譜中，此結(jié)果與We

10、stern-blot鑒定BSP的表達(dá)基本相符。同時(shí)流式細(xì)胞儀分析、Western-blot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)BSP是一個(gè)含N-糖鏈、O-糖鏈及末端唾液酸的糖基化蛋白。
　　 綜上所述，我們成功建立了MC3T3-E1 Subclone14成骨細(xì)胞培養(yǎng)模型；證實(shí)BSP O-糖基化修飾影響成骨主要涉及ppGalNAcT1、T4兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶；BSP相關(guān)的末端唾液酸化主要影響骨礦化的形成，并以α2，3唾液酸為主，但對(duì)成骨細(xì)胞的分化無(wú)明顯影響