基于納米粒子、酶的信號放大生物分析方法研究.pdf

1、發(fā)展靈敏度較高的免疫分析技術一直以來是免疫分析領域研究的一個重要方面，它對于實現(xiàn)一些重要疾病標志物的檢測有著至關重要的意義。電化學儀器具有簡便、靈敏、易于微型化等優(yōu)點。因此，開發(fā)新的電化學信號放大免疫分析技術無疑可以推動免疫分析的發(fā)展。此外，人類的許多遺傳性疾病都是由于基因的變異引起的，其中尤以單堿基的突變，即單堿基多態(tài)性最為普遍。實現(xiàn)對這些基因單堿基突變的早期、準確、簡便、快速的確認，對于人類相關疾病的發(fā)病機理研究及早期治療具有非常重

2、要的意義。目前，有關單堿基突變的檢測方法已有許多報道。而這些傳統(tǒng)的方法普遍操作繁瑣費時、不易定量、儀器昂貴、且對工作人員要求較高的專業(yè)技能，因此僅能在少數(shù)實驗室應用。開發(fā)一些簡便、價廉、精確且易于臨床推廣的方法是一件很有價值的工作。為此，本文主要在高靈敏度的電化學免疫分析方法方面以及電化學DNA檢測技術方面做了一些工作： 1．提出了一種基于循環(huán)富集納米金的新型電化學免疫分析方法。脫硫生物素與親合素的結合常數(shù)比較小，當其與親合素結

3、合后，在生理條件下即可被生物素取代，利用此取代反應可對納米金進行循環(huán)富集，從而實現(xiàn)提高免疫分析靈敏度的目的。免疫分析采用夾心法。先將羊抗人IgG包被在酶標孔里，經牛血清蛋白(BSA)封閉后再加入分析物人IgG，接著加入標記有脫硫生物素的羊抗人IgG形成夾心復合物。然后加入金標親合素溶液進行溫育反應，最后加入生物素溶液通過取代反應實現(xiàn)金標親合素的洗脫。由于脫硫生物素標記的抗體在取代反應后仍保持相當高的生物活性，故可再加入新鮮的金標親合素與

4、上一步保存的生物素溶液進行循環(huán)洗脫，最后通過溶出伏安法(ASV)進行檢測，實驗證實金的陽極溶出峰電流隨循環(huán)富集次數(shù)的增加而逐漸增加，當達到八次后信號趨于穩(wěn)定。為了縮短免疫分析時間，采用5次循環(huán)富集，也可保證較高的靈敏度，檢測限達0.75ng/ml。在空白實驗中，即使循環(huán)富集10次，其背景信號仍是相當?shù)牡??？赡艿迷蚴欠翘禺愋晕降慕饦擞浳镫y以在生理條件下被洗脫，因此大大降低了背景信號，因此如果提高循環(huán)洗脫的次數(shù)可以檢測到0.1 ng/m

5、l人IgG。在同樣的條件下8次檢測1 ng/ml人IgG，相對標準偏差為9.57％。 2．提出了一種基于磁性納米粒子放大金標伏安免疫分析技術。修飾有生物素的磁性納米粒子能夠結合多個金標親和素，形成磁性納米粒子-納米金復合物。利用脫硫生物素修飾抗體，夾心免疫反應后可與磁性納米粒子．納米金復合物特異性結合。通過生物素取代可洗脫復合物，結合溶出伏安分析可實現(xiàn)信號的線性放大。通過生物素的競爭洗脫，可以有效地降低非特異性吸附引起的背景信號

6、，從而為低濃度抗原的檢測提供了可能。我們采用了溶出伏安法檢測，檢測下限為0.1ng/mL。 3．提出了一種基于循環(huán)富集辣根過氧化物酶的用于檢測人IgG的新型熒光免疫分析方法。脫硫生物素與親合素的結合常數(shù)比較小，當其與親合素結合后，在生理條件下即可被生物素取代，利用此取代反應可對辣根過氧化物酶進行循環(huán)富集。當用緩沖液代替抗原進行實驗時，發(fā)現(xiàn)即使循環(huán)富集步驟達到七次其產生的背景信號也相當?shù)?，這種特性使得本方法能夠檢測到0.05 ng/ml的

7、人IgG。 4．提出了一種基于銅增強的金標伏安免疫分析方法。在這種方法中，抗體首先通過物理方法固定到酶標孔內壁，夾心免疫反應后，納米金標記的抗體被捕獲到生物界面。再加入銅增強試劑，由于納米金的晶核催化效應，在還原劑存在的條件下，銅離子在納米金的表面得以還原，形成厚厚的銅殼。然后通過化學法將銅溶解后用溶出伏安法檢測溶出的銅離子。檢測下限為0.5 ng/ml。將本方法應用于實際血樣的分析，取得了滿意的結果。據(jù)我們所知，這是首例將銅增

8、強引入到免疫分析中來的報道。 5．在前面工作的基礎上我們提出了一種基于銅增強新型電化學免疫傳感器的制備方法。在這種方法中，抗體首先通過化學方法修飾到玻碳電極表面，夾心免疫反應后，納米金標記的抗體被捕獲到電極表面。再加入銅增強試劑，由于納米金的晶核催化效應，在還原劑存在的條件下，銅離子在納米金的表面得以還原，形成厚厚的銅殼。然后將傳感器轉移到電解池中施加線性掃描，就可以通過檢測銅的陽極峰電流的大小來實現(xiàn)抗原分子的定量分析。檢測下限

9、為0.075 ng/ml。與傳統(tǒng)的金增強和銀增強比較，本文提出的銅增強具有一定的優(yōu)勢。如避免了溶出伏安分析的繁瑣步驟，采用的銅增強試劑也比較容易配制和保存，同時還保持了較高的靈敏度。 6．結合瓊脂糖免疫微球的分離特性及生物金屬化的概念提出了一種新型電化學免疫分析方法。瓊脂糖微球表面標記有親和素分子，因此我們可以將生物素化的羊抗人IgG通過生物素親和素之間的親和反應標記到瓊脂糖微球表面。形成瓊脂糖免疫微球。然后將固定量的瓊脂糖免疫

10、微球，堿性磷酸酯酶標記的羊抗人IgG抗體以及待測抗原人IgG三者混合反應后分離洗滌四次以保證除去未反應的堿性磷酸酯酶標記的羊抗人IgG抗體以及待測抗原人IgG。最后加入磷酸抗壞血酸酯和硝酸銀的混合溶液，避光反應半小時。分離洗滌八次后用硝酸溶解銀，溶出伏安法檢測銀離子。由于反應是在均相中進行，因此不僅縮短了免疫分析時間，還大大提高了免疫反應的效率。 7．提出了一種基于分子信標和酶催化放大的電化學DNA傳感器的研制方法。我們先將5′