利用磁性納米粒子檢測蛋清中抗生物素蛋白的方法研究.pdf

1、抗生物素蛋白(Avidin)是雞蛋蛋清中的一種天然存在的糖蛋白,因?yàn)槠渚哂锌咕瓜x活性而得到廣泛應(yīng)用。隨著Avidin的發(fā)展,需要靈敏度更高、操作更簡便的蛋白檢測方法。本文在制備磁性納米粒子的基礎(chǔ)上,分別建立了競爭法和夾心法檢測蛋清中的Avidin,并且將這兩種方法與熒光分光光度法比較。研究結(jié)果如下:
　　 采用溶劑熱法制備Fe3O4磁性納米粒子(MNPs),單因素實(shí)驗(yàn)得到最佳制備工藝條件為:0.2702 g FeCl3·6H2

2、O和2.70 g NaAC混合溶解于20 mL乙二醇中,磁力攪拌30 min后加入0.50 g聚乙烯亞胺,磁力攪拌30 min得到均勻粘稠的反應(yīng)前驅(qū)物。量取20 mL反應(yīng)前驅(qū)物到反應(yīng)釜中,200℃下反應(yīng)時(shí)間12 h,自然冷卻后取出用水和無水乙醇洗滌,真空干燥得到Fe3O4納米粒子。
　　 上述最適工藝條件制備的Fe3O4納米粒子通過紅外圖譜分析證明表面含有大量氨基,并且利用對硝基苯甲醛法測得表面氨基含量為14.97 nmol/m

3、g,利用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)測得其飽和磁化強(qiáng)度為64.93 emu/g。根據(jù)TEM觀察結(jié)果可知納米粒子粒徑為30 nm,分散性較好。
　　 將磁性納米粒子與抗體偶聯(lián),討論得到最佳偶聯(lián)條件為:納米粒子先用15％的戊二醛活化,活化后的納米粒子在pH7.4的0.05 M PBS中與抗體偶聯(lián),當(dāng)抗體磁性粒子的質(zhì)量比(μg:mg)為300:1時(shí),抗體的連接效率最高,可以達(dá)到約50μg/mg。
　　 建立了基于磁性納米粒子的測定Avidi

4、n的競爭結(jié)合法。并對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最適合Biotin-MNPs濃度為400μg/mL,HRP-Avidin稀釋度為1:2000,并在測定此條件下Avidin的抑制曲線,由抑制曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:y=-1.4193x+3.9729,相關(guān)系數(shù)R2=0.9838。該方法的最低檢測限為79.4 ng/mL,檢測范圍為79.4-5000.0 ng/mL,批內(nèi)變異系數(shù)為7.22％,批間變異系數(shù)為9.17％。與溶菌酶、BSA、卵白

5、蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白交叉反應(yīng)率均小于0.2％。該方法的回收率在95％-122％之間。
　　 建立了基于磁性納米粒子的測定Avidin夾心法。并對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定免疫磁珠最適濃度為600μg/mL,HRP-Biotin最適稀釋度為1:800,底物顯色條件為室溫下避光反應(yīng)10 min,并在測定此條件下檢測Avidin的標(biāo)準(zhǔn)曲線,以O(shè)D490為縱坐標(biāo),Avidin濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),y=0.2725 x-0.7036,相關(guān)系數(shù)R2=

6、0.9915。該方法的最低檢測限為30ng/mL,線性范圍為31.2-10000.0 ng/mL,批內(nèi)變異系數(shù)為3.49％,批間變異系數(shù)為4.40％。溶菌酶、BSA、卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對應(yīng)的OD490與相同濃度Avidin孔的OD490有明顯差異,該方法的回收率在88.2％-99.4％之間。
　　 用三種方法測定的三個(gè)不同品種雞蛋中的Avidin濃度都在42-60μg/mL左右。對熒光分光光度法和競爭法的檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性和配