基于酶信號放大的新型無標(biāo)記核酸生物傳感方法研究.pdf

1、隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，對生命體中發(fā)揮重要作用的生物分子進(jìn)行分析檢測有重要意義，尤其在疾病的早期診斷，預(yù)防，治療等方面。生物傳感技術(shù)作為分析化學(xué)學(xué)科中的一種前沿的新型分析技術(shù)，具有靈敏度高、選擇性好、成本較低、分析速度快以及能夠進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)，分子生物學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。隨著生物化學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，DNA不再僅僅作為生物體遺傳信息的攜帶者而被熟知，它的更多化學(xué)及生物電子學(xué)性質(zhì)被更加廣泛和深入地研究，如今DNA

2、已發(fā)展成為了新型感應(yīng)材料，催化劑，藥物等。
　　 本研究論文綜合文獻(xiàn)報(bào)道，利用酶信號放大技術(shù)，結(jié)合DNA的生物識別和催化功能，致力于提高檢測靈敏度，線性響應(yīng)范圍，簡化實(shí)驗(yàn)過程，控制實(shí)驗(yàn)成本等幾方面，發(fā)展了幾種新型的無標(biāo)記DNA傳感方法，對幾種重要的生物分子進(jìn)行了特異性好，靈敏度高的分析檢測，工作主要內(nèi)容如下:
　　 (1)構(gòu)建了一種基于PCR核酸擴(kuò)增，甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶酶切和編碼蛋白DNA的體外表達(dá)的新型傳感策略，

3、實(shí)現(xiàn)了對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的靈敏檢測，檢測下限達(dá)0.08 U/mL，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與0.2 U/mL-100 U/mL的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶間存在線性關(guān)系。該方法特點(diǎn)在于通過PCR擴(kuò)增獲得的無標(biāo)記的線性雙鏈DNA，既是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的識別和作用底物，同時(shí)由于其具有啟動子序列和熒光素酶編碼序列，也是體外表達(dá)熒光素酶的模板。只有在甲基化位點(diǎn)保持完整的情況下，模板DNA才能順利進(jìn)行體外的轉(zhuǎn)錄/翻譯過程，表達(dá)產(chǎn)物熒光素酶催化

4、熒光素氧化發(fā)光。（第二章）
　　 (2)基于5'端磷酸化的雙鏈DNA能被Lamda核酸外切酶優(yōu)先識別并酶切，設(shè)計(jì)了一個(gè)簡單的無標(biāo)記的發(fā)夾DNA探針作為反應(yīng)平臺，實(shí)現(xiàn)了對T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK)的檢測。通過PNK和lamda核酸外切酶的共同作用實(shí)現(xiàn)對發(fā)夾探針中DNAzyme的調(diào)控，并利用釋放的DNAzyme與氯化高鐵血紅素(Hemin)結(jié)合催化2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-

5、苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS2-)的顯色反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對PNK的簡單，快速，可視化的靈敏檢測，并對其抑制劑的篩選進(jìn)行了相應(yīng)考查。該分析方法對PNK的檢測下限達(dá)0.06 U/mL，在0.06-100 U/mL之間，紫外-可見吸收光強(qiáng)度的增值與PNK濃度的對數(shù)呈線性相關(guān)。（第三章）
　　 (3)利用等溫循環(huán)鏈置換反應(yīng)，對目標(biāo)分子和信號分子進(jìn)行同步放大，實(shí)現(xiàn)了對MicroRNA的簡單檢測，檢測下限達(dá)0.5 fM，在0.5 fM-