基于貴金屬納米粒子標(biāo)記技術(shù)的均相免疫分析新方法研究.pdf

1、免疫分析利用抗體-抗原間的特異性結(jié)合反應(yīng)對蛋白質(zhì)、藥物、激素、毒素、微生物等物質(zhì)進(jìn)行高選擇性、高親和性定性定量檢測,已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的免疫分析方法如酶聯(lián)吸附免疫方法(ELISA)大多采用非均相模式,操作繁瑣,分析時間長,需要抗體的包埋,多次洗滌和顯色等步驟。難以滿足某些快速檢測的要求。金納米粒子(GNPs)易于合成與修飾,具有生物相容性好、光散射特性高等優(yōu)點,是一種優(yōu)異的光學(xué)標(biāo)記探針。共振光散射相關(guān)光譜(R

2、LSCS)是一種高靈敏度的單顆粒探測方法,該方法基于貴重金屬納米粒子在高聚焦的微區(qū)內(nèi)由于布朗運(yùn)動會產(chǎn)生散射光光強(qiáng)波動,通過對波動進(jìn)行自相關(guān)分析可獲取微區(qū)內(nèi)粒子濃度、擴(kuò)散系數(shù)等信息。
　　本文將單顆粒檢測方法與貴金屬納米粒子(如金和銀納米粒子)標(biāo)記技術(shù)結(jié)合,發(fā)展了一些靈敏的均相免疫分析新方法。本論文研究工作主要包括:
　　1)本文將RLSCS檢測方法和金納米粒子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合,構(gòu)建了肝癌標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)的均相夾心免疫分析

3、新方法。該方法將AFP的兩種抗體通過共價鍵的形式連接到GNPs上,形成金標(biāo)抗體探針。當(dāng)兩種抗體探針與含有抗原的樣品溶液混合,夾心免疫反應(yīng)使GNPs聚集形成二聚或者多聚體,導(dǎo)致溶液中GNPs的特征擴(kuò)散時間的變化,能夠被RLSCS靈敏地檢測到。研究結(jié)果表明GNPs的特征擴(kuò)散時間與抗原濃度的對數(shù)值呈線性相關(guān)。系統(tǒng)地研究各種因素對檢測的影響。在優(yōu)化的條件下,AFP線性范圍為1 pmol/L-1 nmol/L,檢測下限為1 pmol/L。將該方法

4、成功地用于人血清中AFP含量的測定,其結(jié)果與ELISA法一致。與傳統(tǒng)方法相比,該方法操作簡單、分析快速、靈敏度高、選擇性好,耗樣量小。
　　2)競爭免疫模式可同時適用于大分子和小分子的分析。銀納米粒子(SNPs)作為探針載體具有比GNPs更高的光散射強(qiáng)度。將高靈敏的RLSCS方法與銀納米粒子(SNPs)標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,建立了均相競爭免疫分析新方法,用于小分子-雌二醇(E2)和大分子-甲胎蛋白(AFP)分析。此方法將E2抗體和AFP

5、的抗體、抗原通過共價的形式包覆在SNPs表面,E2的半抗原(雌二醇與牛血清白蛋白連接物,BSA-E2)以靜電吸附作用連接在SNPs上。當(dāng)含有E2或AFP的樣品溶液與過量的包覆了抗體的SNPs溶液混合,通過免疫反應(yīng)SNPs@Ab上的一部分位點將被占據(jù),再加入AFP抗原和E2半抗原連接的SNPs,使其占據(jù)剩下的位點,同時形成二聚或多聚的免疫產(chǎn)物。溶液中SNPs的特征擴(kuò)散時間將發(fā)生變化,而這種變化能夠靈敏的被RLSCS檢測到。研究結(jié)果表明SN

6、Ps的特征擴(kuò)散時間與E2和AFP加入濃度的對數(shù)值呈線性相關(guān)。系統(tǒng)地研究了各種因素對檢測的影響。在優(yōu)化的條件下,E2的檢測線性范圍為10 pmol/L-1 nmol/L,檢測下限為10 pmol/L;AFP的檢測線性范圍為100 pmol/L-10 nmol/L,檢測下限為100 pmol/L。將該方法用于人尿液中 E2含量和人血清中 AFP含量的測定,其結(jié)果與傳統(tǒng)的ELISA方法所得的結(jié)果基本吻合。本法具有靈敏度高、操作簡單、分析時間短

7、、普適性強(qiáng)等優(yōu)點,在臨床診斷、食品安全檢測和環(huán)境分析等方面具有廣闊應(yīng)用前景。
　　3) GNPs溶液受到激光照射可產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振散射光子爆發(fā),光子爆發(fā)個數(shù)與溶液中GNPs粒子個數(shù)呈良好的線性關(guān)系?；跈z測基線噪聲滿足高斯分布、納米粒子光子爆發(fā)信號滿足泊松分布的特征,發(fā)展了光子爆發(fā)納米粒子計數(shù)方法。對光子爆發(fā)的強(qiáng)度與相應(yīng)強(qiáng)度下光子爆發(fā)個數(shù)作圖,得到光子爆發(fā)強(qiáng)度與個數(shù)的關(guān)系,通過曲線擬合確定光子爆發(fā)的噪聲分布區(qū)間及其數(shù)學(xué)期望μ和方差σ

8、,設(shè)定閾值=μ+8×σ。通過軟件得到光子爆發(fā)峰的個數(shù)。此方法重現(xiàn)性好、靈敏度高。
　　4)基于光子爆發(fā)計數(shù)技術(shù),發(fā)展了均相免疫分析新方法。分別建立了前列腺特異抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)的夾心和競爭免疫分析方法。其方法的原理類似于散射相關(guān)光譜方法,采用金納米粒子標(biāo)記抗體或抗原。在夾心免疫分析中,免疫反應(yīng)后GNPs會形成一些二聚或者低聚體,導(dǎo)致了溶液中粒子數(shù)目減少,進(jìn)而引起光子爆發(fā)數(shù)目減少,這一變化可以通過光子爆發(fā)計數(shù)檢測技術(shù)

9、靈敏的表征。我們對構(gòu)建的四種分析體系進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化。其中所得 PSA夾心免疫分析的最優(yōu)條件為以680 pmol/L的20 nm GNPs為探針進(jìn)行實驗,線性范圍為1 pmol/L-10 nmol/L,檢測下限為1 pmol/L;PSA競爭免疫分析的最優(yōu)條件為以1.36 nmol/L的20 nm GNPs為探針進(jìn)行實驗,線性范圍為10 pmol/L-10 nmol/L,檢測下限為10 pmol/L;AFP夾心免疫分析的最優(yōu)條件為以340

10、 pmol/L的40 nm GNPs為探針進(jìn)行實驗,線性范圍為1 pmol/L-10 nmol/L,檢測下限為1 pmol/L;AFP競爭免疫分析的最優(yōu)條件為以170 pmol/L的20 nm GNPs為探針進(jìn)行實驗,線性范圍為1 pmol/L-1 nmol/L,檢測下限為1 pmol/L。最后以優(yōu)化后的系統(tǒng)對實際樣品(血清)中PSA和AFP含量進(jìn)行了定量檢測。實驗結(jié)果與傳統(tǒng)的ELISA方法結(jié)果基本吻合。此方法的靈敏度高、選擇性好、樣品