基于單分子-單顆粒技術(shù)的均相免疫分析新方法研究.pdf

1、免疫分析是利用抗原與抗體之間的高特異性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體、抗原或相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的分析方法。免疫分析是一種非常重要的生物分析方法,它被廣泛地應(yīng)用于臨床診斷、食品和環(huán)境分析、生物及醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。目前免疫分析主要以微孔板為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的異相分析模式。這種方法需要抗體的包埋,緩慢的異相免疫反應(yīng),多次耗時(shí)的沖洗,酶放大反應(yīng)和離線檢測(cè)分析等步驟。因此,這種方法操作繁瑣、分析時(shí)間長、不能滿足某些快速檢測(cè)和診斷的要求。均相免疫分析不需要分離,能夠直接測(cè)定免

2、疫反應(yīng)混合體系中的待測(cè)物(抗體或者抗原)。這種方法通常快速,而且很容易實(shí)現(xiàn)微型化和自動(dòng)化。目前某些檢測(cè)方法如熒光偏振、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、生物發(fā)光能量轉(zhuǎn)移被用于均相免疫分析。然而,由于這些檢測(cè)方法的靈敏度較低,不能滿足臨床檢測(cè)的要求。
　　 本論文旨在基于單分子和單顆粒技術(shù),發(fā)展高靈敏的均相免疫新方法,用于腫瘤標(biāo)志物的分析。主要研究工作包括如下幾個(gè)方面:
　　 1)基于熒光自相關(guān)光譜和互相關(guān)光譜,發(fā)展了均相免疫分析方法。為

3、了克服熒光相關(guān)光譜在研究分子間相互作用時(shí),需要分子量相差4倍的限制,本文構(gòu)思了兩個(gè)策略,即采用熒光交叉相關(guān)光譜系統(tǒng)和減小抗原分子的分子量。首先,我們構(gòu)建了一種新型的單激光激發(fā)的熒光交叉相關(guān)光譜系統(tǒng)。采用量子點(diǎn)這種新型的熒光納米材料為探針,以人IgG和羊抗人IgG的免疫反應(yīng)為研究模型,構(gòu)建了均相免疫分析檢測(cè)系統(tǒng)?；谠撓到y(tǒng)我們測(cè)定了免疫復(fù)合物的濃度及其特征擴(kuò)散時(shí)間與動(dòng)力學(xué)半徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單激光激發(fā)的熒光交叉相關(guān)光譜系統(tǒng)克服了現(xiàn)有的熒光交

4、叉相關(guān)光譜的儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜和操作繁瑣的缺點(diǎn),成功地消除了Cross-talk效應(yīng)。然后,我們以人工合成的多肽為免疫抗原,基于熒光自相關(guān)光譜方法,建立了一種均相競爭免疫分析方法。由于多肽抗原具有和生物抗原一樣的生理活性,而且容易制備,使它成為一種理想的抗原。其主要優(yōu)點(diǎn)是分子量小,能滿足熒光自相關(guān)光譜對(duì)分子量的要求。我們利用這個(gè)策略系統(tǒng)地研究了腫瘤標(biāo)志物CA125抗原與其抗體的免疫反應(yīng),對(duì)該競爭免疫反應(yīng)的靈敏度、特異性、可逆性、解離常數(shù)、解離

5、速率等進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明該方法靈敏度約為0.1 nM,可以用于某些較高含量的組分測(cè)定。
　　 2)基于金納米粒子(Gold Nanoparticles,GNPs)在溶液中的布朗運(yùn)動(dòng)和共振散射效應(yīng),我們提出了一種高靈敏的單個(gè)金納米粒子檢測(cè)新方法,稱之為單個(gè)金納米粒子計(jì)數(shù)法(Single Gold Nanoparticles Counter,SGNPC)。它的工作原理是在高聚焦的激光束中,GNPs由于布朗運(yùn)動(dòng)和共振散射效應(yīng)在檢

6、測(cè)的微區(qū)內(nèi)(小于1 fL檢測(cè)體積)產(chǎn)生強(qiáng)的光子爆發(fā)。實(shí)驗(yàn)表明光子爆發(fā)數(shù)與GNPs濃度之間存在非常好的線性關(guān)系(R=0.992)。本文系統(tǒng)地研究了某些因素對(duì)單個(gè)GNPs信號(hào)的影響,發(fā)現(xiàn)GNPs的光子爆發(fā)強(qiáng)度隨其粒徑和激發(fā)光強(qiáng)度增大而顯著增強(qiáng)。我們考察了合并時(shí)間(Bin-time)和測(cè)定時(shí)間對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響。在優(yōu)化的條件下,對(duì)36nmGNPs的檢測(cè)限為17 fM,線性范圍為17 fM到170 pM。該方法具有很好的重現(xiàn)性,光子爆發(fā)數(shù)計(jì)數(shù)的

7、日內(nèi)和日間重現(xiàn)性(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,RSDs)分別為4.1％(n=11)和3.6％(n=7)。進(jìn)而,我們將SGNPC方法成功地與微流控芯片聯(lián)用。研究了在一定流速下,GNPs光子爆發(fā)數(shù)與其濃度和流速的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在一定的壓力場下,GNPs的光子爆發(fā)數(shù)與其濃度同樣具有很好的線性關(guān)系。同時(shí),在相同濃度下,GNPs溶液的流速越大則爆發(fā)數(shù)越多,其檢出限越低。我們相信SGNPC方法以及SGNPC與微流控芯片聯(lián)用系統(tǒng)在均相生物分析領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)

8、用前景。
　　 3)基于SGNPC方法和GNPs標(biāo)記技術(shù),發(fā)展一種高靈敏的均相免疫分析新方法。在均相免疫分析中采用夾心免疫模式,分別將兩種抗體修飾在GNPs探針上。當(dāng)這兩種抗體-GNPs探針加入含有目標(biāo)物(抗原)的樣品中,它們將與目標(biāo)物的結(jié)合,會(huì)導(dǎo)致GNPs形成二聚物(或者低聚體)。隨著目標(biāo)物增加,溶液中的GNPs數(shù)目會(huì)隨之減少。SGNPC可根據(jù)光子爆發(fā)數(shù)的改變來檢測(cè)GNPs數(shù)目上的變化?；谶@種單顆粒技術(shù)建立了腫瘤標(biāo)志物如癌胚

9、抗原(CEA)和α-胎蛋白(AFP)的均相免疫分析方法。在優(yōu)化的條件下,CEA和AFP的檢測(cè)限分別為130 fM和714 fM,該方法比現(xiàn)行的均相免疫分析方法的檢測(cè)限低2個(gè)數(shù)量級(jí)。該方法成功地用于健康個(gè)體與癌癥患者血清中CEA和AFP濃度的測(cè)定。測(cè)定的結(jié)果與ELISA分析結(jié)果基本一致。與現(xiàn)行的方法相比,我們方法具有靈敏度高、操作簡便、分析時(shí)間短等特點(diǎn)。原理上我們的方法適用于各種臨床免疫分析和藥學(xué)上的生物分子識(shí)別反應(yīng)的監(jiān)測(cè)。更重要的是,該

10、方法的檢測(cè)體積少于1 fL,樣品的用量可以縮減到nL水平,可能成為均相免疫分析中高通量檢測(cè)平臺(tái)。
　　 4)GNPs具有非常強(qiáng)的光吸收和散射性質(zhì),被成功地應(yīng)用于生物標(biāo)記、基因載體和光熱治療等領(lǐng)域。GNPs的粒徑對(duì)其光學(xué)和化學(xué)性質(zhì)有至關(guān)重要的影響。然而,在GNPs的生物應(yīng)用中,我們?nèi)狈σ环N有效的方法對(duì)溶液中GNPs(及其連接物)的粒徑和粒徑分布進(jìn)行表征。因此我們提出了一種共振散射相關(guān)光譜技術(shù)(Resonance Light Sca

11、ttering CorrelationSpectroscopy,RLSCS)表征GNPs粒徑分布的新方法。該方法基于共振散射相關(guān)光譜技術(shù),將遺傳算法(GA)用于散射相關(guān)函數(shù)曲線解析,從而獲得GNPs的粒徑和粒徑分布。我們首先參照熒光相關(guān)光譜的理論,提出了散射相關(guān)光譜技術(shù)表征GNPs粒徑分布模型,然后用計(jì)算機(jī)進(jìn)行模擬。在模擬中,首先預(yù)設(shè)了各種粒徑分布模式,通過計(jì)算求得其對(duì)應(yīng)的相關(guān)曲線,用Matlab程序?qū)崿F(xiàn)了遺傳算法。結(jié)果表明遺傳算法.共