單堿基多態(tài)性和蛋白質(zhì)的檢測(cè)新方法研究.pdf

1、基因片段的變異與基因疾病的產(chǎn)生有密切的關(guān)系，其中單堿基多態(tài)性是最常見的遺傳變異。單堿基多態(tài)性的精確、靈敏和特異性檢測(cè)已經(jīng)成為全社會(huì)關(guān)注的問題，并且有望在DNA診斷中起到至關(guān)重要的作用。蛋白質(zhì)是一類重要的生物標(biāo)志物，它的分析檢測(cè)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域具有非常重要的意義。本論文致力于單堿基多態(tài)性和蛋白質(zhì)的檢測(cè)新方法研究，完成了三項(xiàng)工作，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物的快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)。主要內(nèi)容如下：
　　 1.利用適配子-血紅素的復(fù)合物能夠模

2、擬辣根過氧化酶的生物活性，催化魯米諾和雙氧水的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，提出了一種基于連接酶檢測(cè)反應(yīng)和等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，用于單堿基多態(tài)性的檢測(cè)
　　 【第2章】。對(duì)于完全匹配的雜交體，通過連接酶檢測(cè)反應(yīng)，產(chǎn)生大量的探針連接產(chǎn)物，但對(duì)于單堿基錯(cuò)配的雜交體，連接酶不起連接作用。連接產(chǎn)物由于在DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶的共同作用下，發(fā)生等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出大量的血紅素的適配子，適配子與血紅素結(jié)合，形成的復(fù)合物催化魯米諾和雙氧水

3、的化學(xué)反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)，化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度與目標(biāo)鏈濃度成正比，從而實(shí)現(xiàn)單堿基多態(tài)性的定量檢測(cè)，檢測(cè)下限達(dá)到1 pM.我們用該方法對(duì)細(xì)胞色素P450酶系中的異喹胍羥化酶的單堿基多態(tài)性(CYP2D6*10)進(jìn)行了檢測(cè)，使突變型和野生型基因DNA得到了很好的區(qū)分。
　　 2.基于類似的原理，將上述方法改進(jìn)發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了單堿基多態(tài)性更靈敏、更快速的分析檢測(cè)
　　 【第3章】。分析過程包括兩個(gè)并行合作的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，第一步等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)生

4、的核酸鏈可以作為第二步等溫?cái)U(kuò)增的引物，引發(fā)第二步等溫?cái)U(kuò)增，產(chǎn)生了大量的血紅素的適配子，通過檢測(cè)適配子-血紅素復(fù)合物催化產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度，定性定量檢測(cè)單堿基多態(tài)性。
　　 3.適配子傳感技術(shù)與臨近雜交、體外轉(zhuǎn)錄相結(jié)合，建立了一種新的蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)方法
　　 【第4章】。當(dāng)溶液中沒有凝血酶時(shí)，由于兩條探針尾端的互補(bǔ)序列很短，所形成的雜交體的熔鏈溫度很低，在反應(yīng)溫度下，極不穩(wěn)定。然而當(dāng)溶液中存在凝血酶的時(shí)候，適配子探針與凝