微流控液滴生成新器件新方法及其在單分子擴(kuò)增分析與單細(xì)胞捕獲研究中的應(yīng)用.pdf

1、單分子、單細(xì)胞是生物體系的最基本單位。分子之間的不同決定了其引發(fā)反應(yīng)的不同，細(xì)胞之間的不同決定了生命活動(dòng)的不同。因此，深入研究單分子和單細(xì)胞對(duì)人們探索生命活動(dòng)本質(zhì)是十分必要的。與傳統(tǒng)研究對(duì)象不同，單個(gè)分子、單個(gè)細(xì)胞的研究需要更加精準(zhǔn)的研究平臺(tái)，從而避免大背景的干擾，提高信噪比。微流控芯片，是一種將常規(guī)反應(yīng)小型化、集成化新型的技術(shù)。其具有反應(yīng)迅速、反應(yīng)體積小、信噪比高、通量高、結(jié)果精準(zhǔn)、試劑節(jié)約等特點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)十分符合目前對(duì)單分子、單細(xì)胞

2、研究的要求。因此在近些年來，微流控芯片技術(shù)在單分子、單細(xì)胞分析領(lǐng)域得到廣泛的發(fā)展。
　　雖然微流控平臺(tái)在單分子、單細(xì)胞的研究領(lǐng)域內(nèi)，已經(jīng)展現(xiàn)了良好的應(yīng)用價(jià)值和實(shí)用性，但是隨著對(duì)單分子、單細(xì)胞研究的深入，傳統(tǒng)微流控平臺(tái)的一些缺點(diǎn)逐漸顯現(xiàn):昂貴的進(jìn)樣系統(tǒng)、復(fù)雜的液滴生成操作、芯片內(nèi)產(chǎn)物難以回收、死體積大、單細(xì)胞捕獲效率低等。這些問題一直限制著微流控芯片在單分子、單細(xì)胞的研究上得到更大的發(fā)展。針對(duì)上述問題，本論文嘗試解決困擾微流控平臺(tái)的

3、一些問題，論文內(nèi)容主要分為以下三部分:
　　(1)單分子核酸擴(kuò)增及其在數(shù)字化檢測(cè)和功能化產(chǎn)物分析中的應(yīng)用
　　液滴微流控技術(shù)已經(jīng)在單分子核酸擴(kuò)增中顯示出強(qiáng)大的應(yīng)用前景。液滴微流控芯片降低了單分子核酸擴(kuò)增時(shí)的腔體體積、提高了反應(yīng)腔體的通量，并且將數(shù)字化檢測(cè)成為可能。為了克服微流控技術(shù)一直存在的耗時(shí)長、兼容性差、易融合、產(chǎn)物回收難等問題，發(fā)展了一種高通量液滴生成微陣列芯片，用于實(shí)現(xiàn)芯片內(nèi)的單分子核酸擴(kuò)增，數(shù)字化檢測(cè)超低濃度核酸等

4、目的。利用該芯片，我們實(shí)現(xiàn)了對(duì)單分子克隆產(chǎn)物進(jìn)行有效的回收、貯存和后續(xù)分析。我們使用單核酸擴(kuò)增的方式，將單克隆產(chǎn)物直接與靶標(biāo)結(jié)合，考察結(jié)合強(qiáng)度，從而直接得到結(jié)合力強(qiáng)的單克隆產(chǎn)物，大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)核酸適體篩選需要對(duì)分子庫測(cè)序及大量合成的不足。該單分子核酸擴(kuò)增方法對(duì)功能化單克隆的產(chǎn)物分析、核酸測(cè)序和后續(xù)分析儀器兼容性方面也具有極大的應(yīng)用價(jià)值。
　　(2)非泵型高通量液滴生成微流控芯片
　　傳統(tǒng)微流控液滴生成方式已經(jīng)成功在單分子、單

5、細(xì)胞研究上取得一定的成果，然而傳統(tǒng)的液滴生成方式，往往依賴于進(jìn)樣泵對(duì)芯片內(nèi)流體進(jìn)行精密地控制。這增加了液滴的生成成本和復(fù)雜程度，限制了液滴在多種生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用。如何克服液滴生成過程中對(duì)儀器的依賴，簡(jiǎn)化液滴生成操作，成為擴(kuò)大其應(yīng)用范圍的關(guān)鍵。為此，我們開發(fā)兩種非泵型微流控芯片，只需簡(jiǎn)單操作即可形成高通量的液滴的芯片，其分別采用離心式和按壓式進(jìn)行液滴生成。離心式液滴生成芯片，使用離心力控制流體間壓力，通過油水界面處的特殊結(jié)構(gòu)，利用表面張

6、力生成液滴。該方法生成簡(jiǎn)便，液滴直徑均一可控，液相無死體積殘留。這些優(yōu)點(diǎn)克服了傳統(tǒng)液滴生成方式的一些弊端，為后續(xù)將該方法應(yīng)用在單細(xì)胞測(cè)序等領(lǐng)域提供了一定基礎(chǔ)。按壓式瓊脂糖液滴生成方式，通過將液態(tài)瓊脂糖按壓入預(yù)制的PDMS陣列芯片內(nèi)，我們可以高通量地生成直徑均一可控的液滴。而且液滴固定在PDMS陣列中，解決了傳統(tǒng)液滴隨油相飄動(dòng)難以長期對(duì)特定液滴觀察的缺點(diǎn)。此外，利用瓊脂糖固-液轉(zhuǎn)換的特點(diǎn)，瓊脂糖液滴可轉(zhuǎn)化為瓊脂糖微球，從而實(shí)現(xiàn)單一微球的回

7、收與樣品的進(jìn)一步分析的目的。
　　(3)基于流體力學(xué)設(shè)計(jì)的單細(xì)胞高效捕獲微流控芯片
　　單細(xì)胞做為人們研究的熱點(diǎn)，其分離與捕獲一直是人們所急需解決的問題。由于單細(xì)胞體積小，形狀不規(guī)則性，如何高效地分離并捕獲單細(xì)胞成為一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。針對(duì)這一問題，作者設(shè)計(jì)一款用于高效單細(xì)胞捕獲的芯片。該芯片使用簡(jiǎn)便，單細(xì)胞捕獲捕獲效率高、捕獲速度快?；诹黧w力學(xué)計(jì)算優(yōu)化的芯片結(jié)構(gòu)，細(xì)胞捕獲效率可以高達(dá)91％，單細(xì)胞捕獲效率高于70％，該方法克