細(xì)胞化學(xué)刺激的微流控芯片新方法研究.pdf

1、細(xì)胞通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)其微化學(xué)環(huán)境識(shí)別與應(yīng)答的能力，對(duì)于生物體的發(fā)育、組織修復(fù)以及免疫等至關(guān)重要。伴隨微流控芯片細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，借助芯片化學(xué)刺激技術(shù)，體外模擬或重建細(xì)胞外復(fù)雜環(huán)境進(jìn)而觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài)響應(yīng)是研究細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間通訊等細(xì)胞動(dòng)態(tài)信號(hào)的一個(gè)最有效途徑。然而現(xiàn)有的化學(xué)刺激方法主要是基于微灌注，其較長(zhǎng)的溶液切換時(shí)間、較低的時(shí)空分辨率，較弱的溶液操作能力大大限制了其在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。本文通過(guò)創(chuàng)新的微通道結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以及精密的外部控制方

2、式，針對(duì)不同應(yīng)用需求：?jiǎn)渭?xì)胞高時(shí)空局部刺激、單細(xì)胞高精度刺激、多組合波形刺激、高通量細(xì)胞化學(xué)刺激等，建立了五種不同的細(xì)胞化學(xué)刺激新方法，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）設(shè)計(jì)了一種基于水力門控的界面可調(diào)微流控芯片用于研究細(xì)胞間鈣信號(hào)。通過(guò)時(shí)空控制層流狀態(tài)可精確實(shí)現(xiàn)溶液界面的時(shí)空切換。利用微重力和選擇性消化，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)在刺激通道內(nèi)，采用該平臺(tái)成功監(jiān)測(cè)到NIH-3T3細(xì)胞在三磷酸腺苷(Adenosine5'-triphosphate,

3、 ATP)刺激下通過(guò)間隙連接向毗鄰細(xì)胞進(jìn)行鈣信號(hào)的傳遞過(guò)程；采用辛醇抑制細(xì)胞間隙連接，細(xì)胞間鈣波傳遞消失，證明了細(xì)胞間鈣信號(hào)的傳遞確屬間隙連接的作用。
　　（2）提出了一種鞘流門控進(jìn)樣方法（Gated pinched-flow，GPF），并采用理論推導(dǎo)、數(shù)值模擬、熒光素可視化等多種手段對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證。借助鞘流門控高精度的重現(xiàn)性，成功精確刺激了單個(gè)NIH-3T3細(xì)胞的局部，并成功監(jiān)測(cè)到NIH-3T3細(xì)胞在重復(fù)ATP的刺激下通過(guò)間隙

4、連接向毗鄰細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)鈣信號(hào)地傳遞過(guò)程；并且成功實(shí)現(xiàn)高時(shí)間分辨（<50 ms）的刺激位于微通道內(nèi)不同空間內(nèi)的單細(xì)胞。
　?。?）提出了一種高時(shí)空分辨率精確制導(dǎo)微流控化學(xué)刺激策略，能選擇性對(duì)單個(gè)靶細(xì)胞甚至局部進(jìn)行高精度刺激，其溶液交換時(shí)間最快達(dá)到12 ms，刺激液夾細(xì)寬度理論上至無(wú)限小且橫向移動(dòng)分辨率為16.3±2.4μm/0.1 kPa。從理論推導(dǎo)，數(shù)值模擬和可視化實(shí)驗(yàn)等多角度進(jìn)一步驗(yàn)證了所提策略的可行性。同時(shí)，該方法還具有刺激時(shí)

5、間、緩沖時(shí)間、刺激液的寬度和位置均可控等優(yōu)點(diǎn)，借助該方法我們成功進(jìn)行了單細(xì)胞以及細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)信號(hào)研究。
　　（4）嘗試了一種微流控任意化學(xué)波形信號(hào)發(fā)生器用于細(xì)胞動(dòng)態(tài)信號(hào)研究,并采用數(shù)值模擬和可視化實(shí)驗(yàn)等多角度驗(yàn)證了所提策略的可行性。基于此化學(xué)波形發(fā)生器，我們能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)于10赫茲的脈沖化學(xué)波和優(yōu)于0.2赫茲的連續(xù)化學(xué)波。采用快速生成不同濃度的藥物脈沖進(jìn)樣，我們能快速高效得對(duì)同一細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行不同濃度的刺激進(jìn)而快速繪制單細(xì)胞尺度藥物劑量

6、-反應(yīng)曲線。在化學(xué)信號(hào)連續(xù)波實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)受激細(xì)胞既能響應(yīng)不同幅值的信號(hào)，也能截頻響應(yīng)輸入化學(xué)信號(hào)頻率的變化-高保真的響應(yīng)低頻化學(xué)信號(hào)。
　　（5）建立了一種自動(dòng)動(dòng)態(tài)捕獲刺激釋放的單細(xì)胞動(dòng)態(tài)流式細(xì)胞術(shù)方法。借助于該方法我們快速成功獲取了三種激動(dòng)劑:三磷酸腺苷，組胺，乙酰膽堿，對(duì) HeLa細(xì)胞刺激的劑量-反應(yīng)曲線以及半最大效應(yīng)濃度( Concentration for50％ of maximal effect, EC50)，此方法

7、同樣適用于其他激動(dòng)劑以及拮抗劑的研究。進(jìn)一步的，借助其優(yōu)越的流體操控能力，我們成功實(shí)現(xiàn)了三種激動(dòng)劑對(duì)He La細(xì)胞的組合順序刺激以及同時(shí)刺激。借助該技術(shù)，我們成功實(shí)現(xiàn)了同時(shí)捕獲兩種細(xì)胞(HeLa細(xì)胞和 NIH-3T3細(xì)胞)，并對(duì)其進(jìn)行多樣地刺激，實(shí)時(shí)對(duì)比分析其鈣信號(hào)的差異化響應(yīng)。
　　綜上所述，本文針對(duì)不同的應(yīng)用需求提出了五種不同的細(xì)胞化學(xué)刺激的微流控芯片新方法，具有高時(shí)空分辨、高精度、高通量等優(yōu)勢(shì)，在單細(xì)胞以及細(xì)胞間信號(hào)研究和藥