細胞化學刺激的微流控芯片新方法研究.pdf

1、細胞通過信號轉導對其微化學環(huán)境識別與應答的能力，對于生物體的發(fā)育、組織修復以及免疫等至關重要。伴隨微流控芯片細胞技術的發(fā)展，借助芯片化學刺激技術，體外模擬或重建細胞外復雜環(huán)境進而觀察細胞動態(tài)響應是研究細胞內信號轉導、細胞間通訊等細胞動態(tài)信號的一個最有效途徑。然而現(xiàn)有的化學刺激方法主要是基于微灌注，其較長的溶液切換時間、較低的時空分辨率，較弱的溶液操作能力大大限制了其在細胞生物學領域的應用。本文通過創(chuàng)新的微通道結構設計以及精密的外部控制方

2、式，針對不同應用需求：單細胞高時空局部刺激、單細胞高精度刺激、多組合波形刺激、高通量細胞化學刺激等，建立了五種不同的細胞化學刺激新方法，主要研究結果如下：
　　（1）設計了一種基于水力門控的界面可調微流控芯片用于研究細胞間鈣信號。通過時空控制層流狀態(tài)可精確實現(xiàn)溶液界面的時空切換。利用微重力和選擇性消化，使細胞貼壁生長在刺激通道內，采用該平臺成功監(jiān)測到NIH-3T3細胞在三磷酸腺苷(Adenosine5'-triphosphate,

3、 ATP)刺激下通過間隙連接向毗鄰細胞進行鈣信號的傳遞過程；采用辛醇抑制細胞間隙連接，細胞間鈣波傳遞消失，證明了細胞間鈣信號的傳遞確屬間隙連接的作用。
　?。?）提出了一種鞘流門控進樣方法（Gated pinched-flow，GPF），并采用理論推導、數(shù)值模擬、熒光素可視化等多種手段對該方法進行驗證。借助鞘流門控高精度的重現(xiàn)性，成功精確刺激了單個NIH-3T3細胞的局部，并成功監(jiān)測到NIH-3T3細胞在重復ATP的刺激下通過間隙

4、連接向毗鄰細胞進行重復鈣信號地傳遞過程；并且成功實現(xiàn)高時間分辨（<50 ms）的刺激位于微通道內不同空間內的單細胞。
　?。?）提出了一種高時空分辨率精確制導微流控化學刺激策略，能選擇性對單個靶細胞甚至局部進行高精度刺激，其溶液交換時間最快達到12 ms，刺激液夾細寬度理論上至無限小且橫向移動分辨率為16.3±2.4μm/0.1 kPa。從理論推導，數(shù)值模擬和可視化實驗等多角度進一步驗證了所提策略的可行性。同時，該方法還具有刺激時

5、間、緩沖時間、刺激液的寬度和位置均可控等優(yōu)點，借助該方法我們成功進行了單細胞以及細胞間的動態(tài)信號研究。
　?。?）嘗試了一種微流控任意化學波形信號發(fā)生器用于細胞動態(tài)信號研究,并采用數(shù)值模擬和可視化實驗等多角度驗證了所提策略的可行性?；诖嘶瘜W波形發(fā)生器，我們能夠實現(xiàn)優(yōu)于10赫茲的脈沖化學波和優(yōu)于0.2赫茲的連續(xù)化學波。采用快速生成不同濃度的藥物脈沖進樣，我們能快速高效得對同一細胞連續(xù)進行不同濃度的刺激進而快速繪制單細胞尺度藥物劑量

6、-反應曲線。在化學信號連續(xù)波實驗中，我們發(fā)現(xiàn)受激細胞既能響應不同幅值的信號，也能截頻響應輸入化學信號頻率的變化-高保真的響應低頻化學信號。
　?。?）建立了一種自動動態(tài)捕獲刺激釋放的單細胞動態(tài)流式細胞術方法。借助于該方法我們快速成功獲取了三種激動劑:三磷酸腺苷，組胺，乙酰膽堿，對 HeLa細胞刺激的劑量-反應曲線以及半最大效應濃度( Concentration for50％ of maximal effect, EC50)，此方法

7、同樣適用于其他激動劑以及拮抗劑的研究。進一步的，借助其優(yōu)越的流體操控能力，我們成功實現(xiàn)了三種激動劑對He La細胞的組合順序刺激以及同時刺激。借助該技術，我們成功實現(xiàn)了同時捕獲兩種細胞(HeLa細胞和 NIH-3T3細胞)，并對其進行多樣地刺激，實時對比分析其鈣信號的差異化響應。
　　綜上所述，本文針對不同的應用需求提出了五種不同的細胞化學刺激的微流控芯片新方法，具有高時空分辨、高精度、高通量等優(yōu)勢，在單細胞以及細胞間信號研究和藥