微流控芯片細(xì)胞鈣信號研究.pdf

1、鈣離子是一種普遍的細(xì)胞內(nèi)信使，其濃度的時空變化及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響甚至決定細(xì)胞的行為。所以，研究單細(xì)胞鈣信號以及鈣信號在細(xì)胞間的傳遞對于揭示眾多生理過程的機制、攻克人類疾病意義重大。微流控芯片已成為細(xì)胞研究的新型平臺，本文將微流控芯片用于細(xì)胞鈣信號的研究，取得了以下創(chuàng)新性結(jié)果：
　　 ⑴搭建了一套基于微流控多路層流的細(xì)胞局部給藥系統(tǒng)并用來化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞間鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，即鈣波。細(xì)胞經(jīng)負(fù)壓脈沖引入Y形微通道并精確

2、定位在靶區(qū)域內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，用鈣離子熒光探針孵育細(xì)胞。根據(jù)靶細(xì)胞與通道內(nèi)壁的距離設(shè)置微注射泵的流量速度，正壓驅(qū)動三磷酸腺苷（ATP）和緩沖液流體進(jìn)入微通道形成兩路層流，使得靶細(xì)胞的局部暴露于ATP中、毗鄰細(xì)胞暴露于緩沖液中。發(fā)現(xiàn)鈣信號從靶細(xì)胞傳遞到毗鄰細(xì)胞中，且傳遞方向和流體方向相反，說明該鈣波并不是由靶細(xì)胞釋放ATP擴散到毗鄰細(xì)胞介導(dǎo)的；當(dāng)在緩沖液中加入辛醇抑制間隙連接后，鈣波消失，說明鈣波主要是由間隙連接介導(dǎo)的。
　　 ⑵

3、利用雙負(fù)壓系統(tǒng)實現(xiàn)了化學(xué)藥物毫秒刺激單細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)相同的負(fù)壓脈沖接種于十字微通道的靶區(qū)域內(nèi)，控制通道出口端的兩路負(fù)壓使得微通道中ATP和緩沖液的流體狀態(tài)在水力門控和水力聚焦之間快速切換，在靶細(xì)胞附近發(fā)生快速溶液交換（17 ms），形成毫秒長短的ATP脈沖流經(jīng)細(xì)胞。結(jié)果表明20 μM ATP刺激細(xì)胞100 ms使得細(xì)胞表面受體脫敏最小化，受體在50 s內(nèi)即可完全恢復(fù)活性，從而實現(xiàn)同一個細(xì)胞對照試驗。固定ATP濃度為20 μM，變化刺激時間

4、從50 ms到100 ms再到1 s，鈣峰峰高持平；固定刺激時間為100 ms，變化ATP濃度從2 μM到20 μM再到200 μM，鈣峰峰高遞增，嚴(yán)格證明了ATP誘導(dǎo)的鈣釋放是濃度依賴的。然而，當(dāng)ATP在低濃度時，變化刺激時間從30 ms到50 ms再到100 ms，鈣峰峰高遞增，揭示ATP誘導(dǎo)的鈣釋放又是時間依賴的。
　　 ⑶利用雙負(fù)壓系統(tǒng)實現(xiàn)了對細(xì)胞化學(xué)微環(huán)境的時空控制，建立了一種研究細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的新方法。水力門控和水力