用于制備糖芯片新方法的研究.pdf

1、研究背景：近十年來，人們已經(jīng)認(rèn)識到細(xì)胞表面糖鏈與蛋白質(zhì)的相互作用促進(jìn)了細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附，參與了脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育。這種與糖鏈相互作用的蛋白被稱為糖結(jié)合蛋白(glycan.binding protein，GBP)。GBP通過和糖蛋白糖鏈或糖脂糖鏈的相互作用調(diào)控細(xì)胞識別、信號傳遞、細(xì)胞內(nèi)吞以及細(xì)胞生長、分化和凋亡等生物學(xué)行為。腫瘤發(fā)生時(shí)，蛋白質(zhì)和脂分子糖基化的異常導(dǎo)致糖鏈發(fā)生了結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變，相應(yīng)地和這些糖鏈相互作用的GBP的表達(dá)也發(fā)生異

2、常改變。GBP在生物學(xué)進(jìn)程中扮演著十分重要的角色。但是目前仍然缺乏簡便并能夠用于糖鏈與蛋白質(zhì)之間相互識別、相互作用的高通量研究方法。特別是缺乏類似于DNA芯片和蛋白質(zhì)芯片的研究工具，如與此相類似的糖芯片的研究，目前國際上仍處于探索階段。糖芯片技術(shù)平臺的建立將為高通量研究蛋白質(zhì)與糖鏈作用的關(guān)系提供有效的工具。 研究目的：研究制備糖芯片的新技術(shù)；建立糖芯片應(yīng)用平臺體系，應(yīng)用于糖鏈與蛋白質(zhì)之間相互識別、相互作用的研究。 實(shí)

3、驗(yàn)方法：采用了兩種方法來制備羥基衍生化的玻片，通過糖鏈還原末端的半縮醛基與玻片表面的羥基形成糖苷鍵使糖鏈共價(jià)固定在玻片的表面：首先，玻片分別被環(huán)氧化和氨基化，然后用不同的表面化學(xué)修飾方法使玻片表面羥基化。利用羥基衍生化的玻片制備出糖芯片。 研究結(jié)果：開發(fā)出了一種新的便捷有效的方法來制備糖芯片，即利用了糖鏈的還原末端，以糖苷鍵的形式共價(jià)偶聯(lián)其到羥基(.0H)衍生化的玻片上，較好模擬了糖鏈在細(xì)胞表面的天然存在狀態(tài)，生物活性穩(wěn)定。這

4、種制備糖芯片的新技術(shù)固定糖鏈的共價(jià)連接方式簡單、快速、成本較低、實(shí)用。 1.利用羥基化的玻片表面制備出了糖芯片，熒光標(biāo)記的凝集素可以與糖芯片上固定的糖鏈特異性地結(jié)合，用于檢測糖鏈在玻片上的固定效果。通過實(shí)驗(yàn)確定了4.羥基丁酸肼作為偶聯(lián)劑修飾環(huán)氧化玻片，使玻片表面羥基化。優(yōu)化了糖芯片技術(shù)平臺的體系，確定了最佳的實(shí)驗(yàn)條件： a.最佳點(diǎn)樣液是醋酸鈉緩沖液。 b.最佳封閉劑是3％Top Block。 c.

5、最佳孵育液是中性或者弱堿性的磷酸鹽緩沖液。 d.最佳孵育時(shí)間為一個(gè)小時(shí)，最佳孵育溫度為4℃。 e.最佳點(diǎn)樣濃度為1 mmolA。 f.糖芯片儲存條件為4℃。 2.應(yīng)用所建立的糖芯片技術(shù)平臺體系研究了肝臟相關(guān)糖結(jié)合蛋白，通過實(shí)驗(yàn)研究肝臟相關(guān)糖結(jié)合蛋白在不同的發(fā)育階段以及不同樣本中的分布差異以及豐度差異，為進(jìn)一步研究肝臟中糖結(jié)合蛋白奠定了基礎(chǔ)。 3.應(yīng)用所建立的糖芯片技術(shù)平臺體系對健康人血清