單細(xì)菌水平毒素抗毒素系統(tǒng)研究新方法.pdf

1、細(xì)菌的抗藥性危害日益嚴(yán)重，毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)在細(xì)菌內(nèi)的異質(zhì)性表達(dá)是多藥耐受性存留細(xì)胞形成的重要原因。闡明致病菌中毒素-抗毒素系統(tǒng)的作用機理和生理功能對研發(fā)防控致病菌的新策略和疾病診斷治療等具有重要意義。目前，對TA系統(tǒng)的研究主要集中在基因水平或轉(zhuǎn)錄水平，而傳統(tǒng)基于蛋白質(zhì)水平的檢測方法，如Western Blot等都是對大量細(xì)菌裂解液中的毒素抗毒素蛋白進行檢測，是大量細(xì)菌內(nèi)毒素抗毒素蛋白表現(xiàn)的集權(quán)平均。對單細(xì)菌水平的毒素-抗毒素蛋白

2、進行快速逐一分析可揭示因集權(quán)平均而被掩蓋的個體差異，有益于TA系統(tǒng)的異質(zhì)性考察及亞類表征。
　　本論文旨在將雙砷染料-四半胱氨酸體系與免疫熒光技術(shù)聯(lián)用，結(jié)合實驗室自行研制的超高靈敏流式細(xì)胞儀（high sensitivity flow cytometry, HSFCM），通過對單細(xì)菌水平毒素和抗毒素的同時檢測，發(fā)展TA系統(tǒng)研究新方法，建立單細(xì)菌水平毒素、抗毒素蛋白定量表征技術(shù)并考察各參數(shù)之間的相互關(guān)系;建立TA系統(tǒng)在不同應(yīng)激條件下

3、的超高靈敏檢測模式，確定TA系統(tǒng)在誘發(fā)細(xì)菌程序性阻滯和程序性死亡中的作用;引入雙質(zhì)粒體系，考察Lon蛋白對TA系統(tǒng)調(diào)控的單細(xì)菌水平檢測的可行性，為考察TA系統(tǒng)間交互作用并發(fā)展方便、快捷的毒素蛋白誘導(dǎo)因子篩選方法墊定基礎(chǔ)。本研究發(fā)展了單細(xì)菌水平、原位、高通量、普適性的TA系統(tǒng)研究新方法，對揭示TA系統(tǒng)的作用機理和研究對抗致病菌及細(xì)菌耐藥性的戰(zhàn)略具有重要價值。
　　論文第一章為文獻綜述。重點介紹了毒素抗毒素系統(tǒng)現(xiàn)有的研究方法和單細(xì)菌水

4、平研究TA系統(tǒng)的重要性及超高靈敏流式檢測裝置在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用。本章的最后介紹了本論文的選題思路和主要研究內(nèi)容。
　　論文第二章我們以MqsR/MqsA TA系統(tǒng)為研究對象，構(gòu)建了毒素帶TC標(biāo)簽和抗毒素帶TC標(biāo)簽的重組體系。通過對染色方法、染色時間、染料濃度等的優(yōu)化，經(jīng)HSFCM檢測，天然啟動子下抗毒素及毒素帶TC標(biāo)簽實驗組與不帶TC標(biāo)簽的陰性對照組的TC-FlAsH熒光信號可以明顯區(qū)分，成功建立了TA-TC-FlAsH的單熒光檢

5、測體系，實現(xiàn)了對天然啟動子下單細(xì)菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白的分別檢測。通過對不同表達(dá)量TA系統(tǒng)的檢測，確定了我們的方法能夠靈敏檢測出毒素蛋白和抗毒素蛋白含量的微小變化，為體系應(yīng)用于應(yīng)激條件下TA系統(tǒng)的含量檢測提供了可行性驗證。通過在實驗室模擬氨基酸饑餓，異亮氨酸饑餓和熱激等幾種細(xì)菌常見的應(yīng)激環(huán)境，結(jié)合HSFCM，建立了TA系統(tǒng)應(yīng)激模式的TA-TC-FlAsH體系超高靈敏分析方法。對不同應(yīng)激條件下MqsA蛋白的表達(dá)水平進行檢測，結(jié)果表明抗

6、毒素對不同的應(yīng)激條件表現(xiàn)不同:氨基酸饑餓會促使抗毒素蛋白MqsA的降解，異亮氨酸饑餓下抗毒素MqsA的降解是一個可以恢復(fù)的過程，對熱應(yīng)激抗毒素MqsA表現(xiàn)不敏感。
　　論文第三章為實現(xiàn)對單細(xì)菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白的同時檢測，我們將TC序列和His-tag分別構(gòu)建在毒素和抗毒素序列的末端使其融合表達(dá)，將雙砷染料-四半胱氨酸標(biāo)簽體系與免疫熒光技術(shù)聯(lián)用，結(jié)合HSFCM建立了單細(xì)菌水平天然啟動子下毒素蛋白和抗毒素蛋白同時檢測的雙熒光超

7、高靈敏分析法。利用雙熒光分析方法對低拷貝數(shù)的天然啟動子指導(dǎo)下的TA系統(tǒng)進行檢測，同時帶His-tag和TC-tag的實驗組跟不帶雙標(biāo)簽的陰性對照組熒光信號的完全分離;對不同表達(dá)量的TA系統(tǒng)進行檢測，驗證了所建立的雙熒光分析方法可以靈敏、準(zhǔn)確地對單個細(xì)菌內(nèi)毒素蛋白和抗毒素蛋白的微量變化進行雙參數(shù)同時表征。
　　論文第四章為建立單細(xì)菌水平TA系統(tǒng)調(diào)控模式的超高靈敏分析方法，我們進一步引入pBAD30-lon構(gòu)建雙質(zhì)粒體系，通過誘導(dǎo)Lo

8、n蛋白酶來調(diào)控TA系統(tǒng)的表達(dá)，利用HSFCM對細(xì)菌進行快速地逐一檢測分析，探究Lon蛋白酶調(diào)控下單細(xì)菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白相對含量的變化。結(jié)果表明，與正常生長條件下細(xì)菌表達(dá)的TA系統(tǒng)相比，Lon蛋白酶誘導(dǎo)表達(dá)的pT5-lac下的實驗組，其抗毒素蛋白MqsA在Lon蛋白酶作用5-8 h的時候發(fā)生降解，而相應(yīng)的毒素蛋白含量變化不大，單個細(xì)菌內(nèi)毒素蛋白與抗毒素蛋白的相對比率上升;Lon蛋白酶誘導(dǎo)表達(dá)的天然啟動子下的實驗組，其抗毒素蛋白Mq