集胞藻PCC6803染色體上毒素-抗毒素系統(tǒng)ssl2138-sll1092的研究.pdf

1、細(xì)菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)(Toxin-antitoxin,TA system)最早發(fā)現(xiàn)于低拷貝細(xì)菌質(zhì)粒上,其作用是維持質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性。通常由毒素基因和抗毒素基因構(gòu)成,根據(jù)抗毒素基因編碼產(chǎn)物的的生化本質(zhì),可分為RNATA系統(tǒng)(Ⅰ型TA系統(tǒng))和蛋白TA系統(tǒng)(Ⅱ型TA系統(tǒng))。Ⅱ型TA系統(tǒng)也廣泛存在于細(xì)菌染色體上,毒素基因和抗毒素基因共同表達(dá)并分別編碼毒素和抗毒素蛋白；毒素和抗毒素蛋白可以相互作用形成復(fù)合體,這種復(fù)合體或抗毒素蛋白都能與

2、其啟動(dòng)子上的調(diào)控序列結(jié)合,反饋抑制操縱子的轉(zhuǎn)錄；抗毒素可被依賴(lài)ATP的蛋白酶降解,因此是不穩(wěn)定的蛋白。迄今,除少數(shù)細(xì)菌染色體上的TA系統(tǒng)的生理功能得以證明,如大腸桿菌染色體上的relBE和mazEF系統(tǒng)可介導(dǎo)環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制或細(xì)胞死亡,多數(shù)TA系統(tǒng)的功能尚不清楚。藍(lán)藻是廣泛分布并能應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫的真細(xì)菌,其染色體上也存在大量的TA系統(tǒng)基因,生物信息學(xué)分析顯示單細(xì)胞藍(lán)藻集胞藻PCC6803染色體上至少有30對(duì)TA系統(tǒng),但其生理功能

3、和生化遺傳特征尚不清楚。此前,本實(shí)驗(yàn)室已初步證明ssl2138／sll1092可能構(gòu)成一對(duì)TA系統(tǒng),ssl2138為抗毒素基因,sll1092為毒素基因。本文對(duì)該TA系統(tǒng)進(jìn)行了如下研究:
　　 1)在大腸桿菌中誘導(dǎo)ssl2138／sll1092共表達(dá),借助親和捕捉技術(shù)共純化重組蛋白,通過(guò)肽譜分析共表達(dá)產(chǎn)物Ssl2138和Sll1092,證明它們之間相互作用形成復(fù)合體；
　　 2)通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建ssl2138／sll

4、1092缺失突變株DR649,以抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的壯觀霉素和過(guò)氧化氫作為誘導(dǎo)劑,分析缺失突變株的表型,初步確定ssl2138／sll1092基因在脅迫條件下的生理功能；
　　 3)通過(guò)構(gòu)建由銅離子誘導(dǎo)sll1092和ssl2138／sll1092共表達(dá)的誘導(dǎo)表達(dá)突變株,分析ssl2138／sll1092系統(tǒng)基因編碼產(chǎn)物的生物活性；
　　 4)以LacZ為報(bào)告基因,構(gòu)建ssl2138／sll1092系統(tǒng)的各種表達(dá)調(diào)控突變

5、株,通過(guò)測(cè)定不同表達(dá)調(diào)控突變株中報(bào)告基因的表達(dá),揭示ssl2138／sll1092系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)控方式；
　　 5)利用大腸桿菌選擇性表達(dá)系統(tǒng),分別將蛋白酶基因和毒素-抗毒素(或抗毒素)基因置于啟動(dòng)子PT7和PBAD控制下,在大腸桿菌中選擇性誘導(dǎo)表達(dá)蛋白酶Lons或ClpP2s／Xs以及Ssl2138／sll1092,通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)特征分析以及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)證明集胞藻PCC6803中的蛋白酶Lons和Cl

6、pPs2對(duì)Ssl2138抗毒素蛋白的降解。
　　 通過(guò)上述研究得到以下結(jié)論:
　　 1)ssl2138編碼的抗毒素蛋白Ssl2138和ssll092編碼的毒素蛋白Ssl1092在體內(nèi)相互作用形成復(fù)合體,抑制毒素蛋白的細(xì)胞毒性作用。
　　 2)ssl2138／sll1092基因的缺失導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)蛋白合成抑制型抗生素的敏感性增加,但對(duì)過(guò)氧化物的敏感性不變。表明ssl2138／sll1092可能與環(huán)境脅迫因素誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合