集胞藻PCC6803基因slr2049定點突變及其體內(nèi)重組功能研究.pdf

1、2006年,Zhao等在魚腥藻Anabaenasp.PCC7120中發(fā)現(xiàn)了一種色素裂合酶基因cpeS(編號為alr0617),該基因編碼的色素裂合酶CpeS可以催化藻藍(lán)膽素(PCB)連接到藻藍(lán)蛋白或者藻紅藍(lán)蛋白的β亞基Cys-84位點上。經(jīng)過同源軟件的分析,在集胞藻Synechocystissp.PCC6803中,找到了基因slr2049,它和基因cpeS具有很高的同源性。本實驗室已經(jīng)對基因slr2049的功能有了初步的研究,證明該基因

2、所編碼蛋白是具有與其同源蛋白CpeS有相似的功能,即也是一種色素裂合酶。
　　為了進(jìn)一步的對該基因的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系有深刻的了解,本實驗運用定點突變技術(shù),對蛋白Slr2049的某些氨基酸位點進(jìn)行點突變。針對的氨基酸位點是通過比對軟件,讓Slr2049和其他六種有相同功能的蛋白CpeS蛋白序列進(jìn)行對比,得到的22個保守性的氨基酸位點中選取八個,選取這些氨基酸位點同時也考慮它們的結(jié)構(gòu)特點與理化性質(zhì)。在大腸桿菌中合成具有熒光性的藻藍(lán)

3、蛋白β-亞基的需要另外的3個相關(guān)基因:血紅素加氧酶1基因(ho1),藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶基因(pcyA)以及脫輔基蛋白β亞基基因(cpcB)。首先通過改進(jìn)的提取DNA的方法來提取集胞藻PCC6803的總DNA,再設(shè)計引物同時在引物上加入相應(yīng)的酶切位點,進(jìn)行PCR得到目的片段;構(gòu)建野生型slr2049和八個突變體slr2049以及上述三個相關(guān)基因的克隆質(zhì)粒,將以上的這些基因兩兩結(jié)合構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pCDF-cpcB-slr2049野生型和

4、八個pCDF-cpcB-slr2049突變體以及pET-ho1-pcyA,然后將野生型和突變體的表達(dá)質(zhì)粒分別與pET-ho1-pcyA共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21體內(nèi),讓它們進(jìn)行異源體內(nèi)重組,通過IPTG的誘導(dǎo),得到了重組蛋白;由于載體上自帶了組氨酸標(biāo)記,得到的野生型重組蛋白和突變體的重組蛋白可用鎳柱親和層析的方法進(jìn)行純化,再把它們分別進(jìn)行光譜測定。
　　SDS-PAGE和光譜測定的實驗結(jié)果顯示,野生型slr2049和突變體slr20

5、49(H21S)/slr2049(L23S)/slr2049(F25S)/slr2049(W72L)/slr2049(G84S)/slr204-9(Y124S)催化的重組蛋白分別在623nm和640nm左右有最大吸收峰和熒光發(fā)射峰,與天然的蛋白的最大吸收峰和熒光發(fā)射峰分別在625nm和645nm相近;而突變體slr2049(A24S)/slr2049(R107S)所催化的重組蛋白則沒有出現(xiàn)最大吸收峰和熒光發(fā)射峰;突變體slr2049(L

6、23S)/slr2049(W72L))/slr2049(G84S)所催化的重組蛋白雖然有吸收峰,但是吸收峰處的最大值與野生型slr2049催化的重組蛋白的吸收峰值相比明顯要小很多。可知野生型slr2049和突變體slr2049(H21S)、slr2049(L23S)、slr2049(A24S)、slr2049(F25S)、slr2049(W72L)、slr2049(G84S)、slr2049(R107S)、slr2049(Y124S)之

7、間是有光譜吸收峰值差異的,這可以說明這八個突變位點對催化形成藻藍(lán)蛋白β亞基的能力也是有差異的。從光譜圖上可說明24、107位的丙氨酸和精氨酸是色素裂合酶必需氨基酸,是其酶活中心;21、25、124位的組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸對色素裂合酶的催化作用無明顯影響,不是必需氨基酸;23、72、84位的亮氨酸、色氨酸和甘氨酸是色素裂合酶催化作用的關(guān)鍵位點,這三個氨基酸的突變能影響它的活性,降低它的催化能力。造成這一差異可能的原因是氨基酸的定點突變

8、能造成蛋白的結(jié)構(gòu)和溶解性改變,從而影響了蛋白的催化能力。
　　為了了解上述的重組蛋白是否是有效表達(dá)的,同時證明另外兩個突變體有沒有進(jìn)行有效的表達(dá),用特殊制作的一抗,進(jìn)行Westernblot反應(yīng)。通過SDS-PAGE和Westernblot技術(shù)對各表達(dá)蛋白進(jìn)行了檢測和驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),由野生型slr2049和突變體slr2049(H21S)/slr2049(L23S)/slr2049(F25S)/slr2049(W72L)/slr2