集胞藻PCC6803染色體上ssl2245-sll1130系統(tǒng)的鑒定和生理功能的初步研究.pdf

1、細(xì)菌毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin，TAsystem)系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌的低拷貝質(zhì)粒上，通過(guò)分離后死亡機(jī)制維持質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的遺傳穩(wěn)定性。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)不同家族的TA系統(tǒng)也廣泛存在于真細(xì)菌和古細(xì)菌的染色體上，并具有多種不同的生理功能。大腸桿菌染色體上的mazEF系統(tǒng)是目前研究最為深入的TA系統(tǒng)之一，與細(xì)胞耐受多種環(huán)境脅迫有關(guān)。mazEF家族的TA系統(tǒng)也廣泛存在于其他細(xì)菌染色體上，如具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力的藍(lán)藻染色體上也存

2、在mazEF系統(tǒng)同源基因，但其生理功能還不清楚。此前本實(shí)驗(yàn)室利用大腸桿菌選擇性表達(dá)系統(tǒng)初步鑒定了模式藍(lán)藻集胞藻PCC6803染色體上mazEF同源基因ssl2245/sll1130:誘導(dǎo)sll1130表達(dá)可抑制大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)，反式誘導(dǎo)ssl2245表達(dá)可抵抗Sll1130對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。因此基因ssl2245/sll1130可能構(gòu)成集胞藻PCC6803染色體上與mazEF家族的TA系統(tǒng)。本論文對(duì)ssl2245/sll1130基因

3、對(duì)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。主要內(nèi)容包括:
　　 1)在大腸桿菌中誘導(dǎo)ssl2245/sll1130共表達(dá)，借助親和捕捉技術(shù)共純化重組蛋白，通過(guò)肽質(zhì)譜分析共表達(dá)產(chǎn)物Ssl2245和Sll1130證明它們之間存在相互作用可形成復(fù)合體。
　　 2)通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建ssl2245/sll1130缺失突變株DR1404，分析了缺氮、乙醇、丁醇、已烷以及過(guò)氧化氫脅迫的條件下突變株的表型。
　　 3)以lacZ為報(bào)告基因，構(gòu)建s

4、sl2245/sll1130系統(tǒng)與lacZ融合轉(zhuǎn)錄的調(diào)控突變株，通過(guò)測(cè)定不同表達(dá)調(diào)控突變株的半乳糖苷酶活性，確定ssl2245/sll1130在異源宿主細(xì)胞和自源宿主細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控。
　　 4)利用大腸桿菌選擇性表達(dá)系統(tǒng)，在啟動(dòng)子PT7(1)ac和PBAD控制下分別選擇性誘導(dǎo)表達(dá)集胞藻依賴ATP的蛋白酶Lons和ClpXP2s以及Ssl2245/sll1130，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblot)分析蛋白酶Lons和C

5、lpXP2s對(duì)Ssl2245抗毒素蛋白的降解作用。
　　 通過(guò)上述研究得到以下結(jié)論:
　　 1)ssl2245編碼的抗毒素蛋白Ssl2245和sll1130編碼的毒素蛋白Sll1130可在體內(nèi)相互作用形成復(fù)合體，并抑制毒素蛋白的細(xì)胞毒性作用。
　　 2)ssl2245/sll1130與細(xì)胞適應(yīng)缺氮或氧化脅迫無(wú)關(guān)，但可能參與藻細(xì)胞適應(yīng)己烷的脅迫。
　　 3)與典型的Ⅱ型TA系統(tǒng)一樣，ssl2245/sll1