毒素-抗毒素系統(tǒng)與結(jié)核分枝桿菌持留性的相關(guān)研究.pdf

1、目的：本研究擬通過構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)缺失株，初步研究其在不同培養(yǎng)條件下對(duì)結(jié)核分枝桿菌生存能力的影響，并對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)與結(jié)核分枝桿菌持留性相關(guān)性進(jìn)行初步探討。
　　方法：1.結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)缺失株的構(gòu)建及鑒定。首先以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分別從H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和PUC-19K質(zhì)粒上擴(kuò)增出目的基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因；然后應(yīng)用融合PCR技術(shù)將目的基因的同源臂和kan基因進(jìn)行雜交拼接，獲得目

2、的融合片段，將該融合片段克隆于pMD-19T(simple)載體形成自殺質(zhì)粒pMD-19T-ΔmazEF-kan和自殺質(zhì)粒pMD-19T-ΔrelBE-kan，并將自殺質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中；最后利用電穿孔技術(shù)將自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至H37Rv感受態(tài)細(xì)胞中；在卡那霉素抗性改良羅氏培養(yǎng)基上篩選出H37RvΔmazEF和H37RvΔrelBE缺失突變株單個(gè)菌落，提取陽性菌株全基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增克隆片段并測序，并對(duì)所獲得H37R

3、vΔmazEF和H37RvΔrelBE缺失突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測。2.結(jié)核分枝桿菌H37RvΔMazEF缺失突變株的生長表型和在不同培養(yǎng)條件下生存能力的初步檢測。分別對(duì)野生型和缺失株進(jìn)行抗酸染色，鏡下觀察菌株形態(tài)學(xué)的改變；分別在低氧和營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)缺失株和野生株，并在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，比較野生株和缺失株在應(yīng)激條件下，生存能力是否存在差異。3.分別用H37Rv、H37RvΔmazEF3、H37RvΔmazEF6和H37

4、RvΔmazEF9菌株感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，通過CFU計(jì)數(shù)初步檢測結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后細(xì)菌的生存能力；利用流式細(xì)胞儀CELLQest和WinMDl2.9 Version軟件檢測巨噬細(xì)胞感染后的凋亡情況。
　　結(jié)果：經(jīng)傳代15代后，再次測序，未發(fā)生回復(fù)性突變，得到具有遺傳穩(wěn)定性的H37RvΔMazEF和H37RvΔRelBE基因缺失株。抗酸染色顯示，H37RvΔmazEF菌株較野生菌株其形態(tài)短小；同時(shí)，CFU計(jì)數(shù)結(jié)