四對結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素基因功能的初步研究.pdf

1、目的：
　　結(jié)核病（Tuberculosis，TB）是由感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）而引起的傳染性疾病。結(jié)核分枝桿菌具有潛伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）的特點(diǎn)，約10％的LTBI患者最終會發(fā)展為活動性結(jié)核（active tuberculosis）。結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，參與產(chǎn)生持留菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)（to

2、xin-antitoxin system，TAS）是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的原因之一。根據(jù)前期生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌“現(xiàn)代”譜系（modern lineage）具有遠(yuǎn)多于“古老”譜系（ancient lineage）的毒素基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）突變位點(diǎn)，這種基因多態(tài)性分布可能是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌“現(xiàn)代”譜系相較于“古老”譜系更適應(yīng)于不同宿主環(huán)境，并在傳播力、

3、耐藥性等方面得到體現(xiàn)。結(jié)核分枝桿菌全基因組上已知有88個假定的TAS，其中有47個VapBC家族的同源位點(diǎn)。本研究選取結(jié)核分枝桿菌Ⅱ型毒素-抗毒素系統(tǒng)中的4個 VapBC家族同源位點(diǎn)（ VapBC12、VapBC37、VapBC38、VapBC47）作為研究對象，初步建立篩選有功能的毒素基因的方法，為探討結(jié)核分枝桿菌的傳播機(jī)制提供新的研究思路。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期生物信息學(xué)分析結(jié)果，選取結(jié)核分枝桿菌Ⅱ型TAS V

4、apBC家族的四對具有一定譜系分化特征及蛋白功能預(yù)測的毒素-抗毒素基因（VapBC12、VapBC37、VapBC38、VapBC47）作為研究對象。首先，將 VapC毒素基因分別克隆入阿拉伯糖誘導(dǎo)質(zhì)粒 pBAD33，構(gòu)建了毒素基因在大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)中的誘導(dǎo)表達(dá)體系；之后，將VapC毒素基因分別克隆入乙酰胺誘導(dǎo)的穿梭質(zhì)粒pACE，構(gòu)建毒素基因在恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegm

5、atis,M. smegmatis）中的誘導(dǎo)表達(dá)體系；觀察VapC毒素基因?qū)煞N不同細(xì)菌的生長是否具有抑制作用，同時構(gòu)建VapB抗毒素基因在E.coli與M. smegmatis的誘導(dǎo)表達(dá)體系，觀察其對同源VapC毒素基因可能的抑菌作用是否存在消除抑制的功能。最后，對驗(yàn)證為具有毒素功能的VapC37構(gòu)建原核表達(dá)與純化體系，為進(jìn)一步的體外生物學(xué)功能驗(yàn)證建立基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：
　　1.所選取的四個VapC基因僅VapC37（Rv

6、2103c）在大腸桿菌中表現(xiàn)為可見的抑菌作用，同源的VapB37（Rv2104c）抗毒素基因具有消除其抑菌作用的抗毒素功能。
　　2.所選取的四個VapC基因僅VapC37（Rv2103c）在恥垢分枝桿菌中表達(dá)為明顯的抑制生長作用，同源抗毒素基因VapB37(Rv2103c)具有對此種生長抑制的中和作用。并且，所選毒素基因與抗毒素基因在大腸桿菌中的克隆表達(dá)結(jié)果同恥垢分枝桿菌中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　3.對以上不同菌種中均表現(xiàn)為

7、功能性的毒素基因VapC37構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，優(yōu)化其誘導(dǎo)表達(dá)與純化方案，目的蛋白最終以包涵體蛋白的形式由親和層析的方法完成純化，之后通過復(fù)性與透析處理，得到了較高純度與濃度的可溶性目的蛋白。4.對前期生物信息學(xué)分析所得SNP篩選TAS相關(guān)突變位點(diǎn)進(jìn)行非同義突變預(yù)測，所得結(jié)果表明我國廣泛流行的北京譜系具有較多的TAS，同時 VapC37在北京譜系中具有更多的有功能的SNP位點(diǎn)，這可能間接導(dǎo)致該譜系具有較強(qiáng)的傳播力與致病性。
　　結(jié)論

8、：
　　結(jié)核分枝桿菌全基因組88個假定的TAS中，國外有報(bào)道78個毒素基因已在恥垢分枝桿菌中克隆并表達(dá)，其中30個被確認(rèn)為功能性TAS；另有30個公認(rèn)的結(jié)核分枝桿菌 TAS在大腸桿菌中表達(dá)為有功能的TAS。本實(shí)驗(yàn)中， VapC12（Rv1720c）在大腸桿菌的毒素驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)為無毒素作用，與已有實(shí)驗(yàn)報(bào)道結(jié)果相符，其余3個毒素基因無相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；VapC37（Rv2103c）在恥垢分枝桿菌中驗(yàn)證為具有毒素功能，VapC12（Rv