擬態(tài)弧菌外毒素的檢測及中草藥抑菌抗毒素活性的研究.pdf

1、擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)是一種常見的病原弧菌，不僅可引起魚蟹類嚴(yán)重的腹水病，而且還可以通過水產(chǎn)動物和水產(chǎn)品感染人類，引起腹瀉和食物中毒。目前該病防治的主要方法是使用抗生素，但是隨著抗生素的反復(fù)使用，細(xì)菌耐藥性問題和藥殘所致的水產(chǎn)品安全問題愈來愈突出。為此，本課題以擬態(tài)弧菌安徽分離株為研究對象，在探明其耐藥性和外毒素致病性的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究了中草藥對擬態(tài)弧菌的抑菌抗毒素活性，旨在篩選出最佳中草藥復(fù)方，為后續(xù)臨床試驗(yàn)研究提供

2、材料，以及為研制治療腹水病的中草藥制劑奠定基礎(chǔ)。 首先，對擬態(tài)弧菌安徽分離株進(jìn)行外毒素基因PCR檢測和外毒素致病性測定。研究中根據(jù)擬態(tài)弧菌或霍亂弧菌的外毒素基因 (vmhA、hlyA、ctxA、zot、ace)序列設(shè)計(jì)引物，以細(xì)菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增外毒素基因，構(gòu)建其重組質(zhì)粒并進(jìn)行序列測定與分析。結(jié)果顯示：4株擬態(tài)弧菌均攜帶外毒素基因，但不同分離株的毒素基因型有所不同，分別為 vmhA<'+>hlyA<'-> ctxA

3、<'->zot<'-> ace<'-> (HX4菌株)、vmhA<'->hlyA<'+> ctxA<'->zot<'->ace<'-> (04-13菌株)、vmhA<'->hlyA<'+>ctxA<'->zot<'+>ace<'->(04-14菌株)和vmhA<'->hlyA<'->ctxA<'->zot<'+>ace<'->(04-5菌株)。HX4菌株vmhA片段長1 391 bp，與擬態(tài)弧菌唯一參考株的相應(yīng)核苷酸同源性達(dá)97.3％；

4、04-13和04-14菌株的hlyA片段長934 bD，與國內(nèi)外參考株的同源性在92.4％～99.3％之間。在應(yīng)用蛋白分離技術(shù)提取擬態(tài)弧菌外毒素的基礎(chǔ)上，采用血瓊脂平板擴(kuò)散法和微量板法測定其溶血性，采用動物實(shí)驗(yàn)法測定其致病性。結(jié)果顯示4株擬態(tài)弧菌外毒素對實(shí)驗(yàn)小鼠和草魚均有極強(qiáng)的腸毒性和致死性。除04-5分離株無溶血性外，其余3株均具有溶血活性，溶血價在1：64～1：256之間。表明外毒素在擬態(tài)弧菌致病過程中起著重要作用。 其次，

5、對擬態(tài)弧菌安徽分離株進(jìn)行耐藥性檢測。研究中采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法測定了4株擬態(tài)弧菌對19種抗生素的耐藥性。結(jié)果顯示它們對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖甙類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗生素均有不同程度的耐藥性，呈現(xiàn)多重耐藥性。 最后，系統(tǒng)測定中草藥對擬態(tài)弧菌的抑菌抗毒素活性以及對草魚腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量和優(yōu)勢菌群種類的影響。研究中采用平板打孔法測定27味中草藥的體外抑菌活性，并選取抑菌活性為中敏和中敏以上的中草藥，采用改良微量稀釋法測定其

6、最低抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。結(jié)果顯示黃連、大黃、金銀花和秦皮的抑菌活性最好，達(dá)到高度敏感，其MIC值在1.96～62.72 g/L之唰，其次為夏枯草、地錦草、丹皮、連翹和黃柏，達(dá)到中度敏感，其MIC值在31.36～250 g/L之間。 以上述9味中草藥為主藥，在主藥中加入佐藥茯苓和車前子以及使藥黃芪和甘草組成5個復(fù)方測定其體外抑菌和間接拮抗毒素活性。結(jié)果顯示復(fù)方5的體

7、外抑菌活性最好，對4株擬態(tài)弧菌的MIC值均為1.96 g/L；其次是復(fù)方1和復(fù)方3，其MIC值在1.96～7.84 g/L 之間：復(fù)方2和復(fù)方4的抑菌活性較低，其MIC值在31.36～125 g/L 之間。復(fù)方5的間接拮抗毒素活性最強(qiáng)，復(fù)方2、復(fù)方3和復(fù)方4次之，復(fù)方1不具有抗毒素活性。綜合考慮確定復(fù)方5的配伍效果最好，具有較強(qiáng)的體外抑菌和間接抗毒素分泌的作用。 進(jìn)一步采用人工感染試驗(yàn)和細(xì)菌學(xué)方法分別測定復(fù)方5的體內(nèi)抗菌活性及其