線性中和表位在抗毒素免疫保護(hù)中的作用研究.pdf

1、一種抗毒素能否有效地中和生物毒素,取決于它結(jié)合生物毒素中和表位的能力,因此,中和表位是免疫保護(hù)作用的核心靶點(diǎn).線性中和表位由于其氨基酸序列在一級(jí)結(jié)構(gòu)上是連續(xù)的,較容易在體外模擬其天然表位.因此,該研究采用線性中和表位作為靶標(biāo),應(yīng)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù),進(jìn)行了人源抗毒素制備的研究,旨在獲得特異、高親和力的人源抗毒素,探討以線性中和表位作為免疫、篩選抗原制備抗毒素的可行性,從而為其它中和抗毒素的制備提供理論和技術(shù)依據(jù).該研究依據(jù)狂犬病毒糖蛋白G

2、p線性中和表位G5的氨基酸序列合成表位多肽G5-24,用狂犬病毒Vero疫苗和G5-24表位多肽對(duì)三名志愿者進(jìn)行了免疫,從免疫者外周血淋巴細(xì)胞中分離、構(gòu)建了單鏈抗體(scFv)基因,應(yīng)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)構(gòu)建抗狂犬病毒人源噬菌體單鏈抗體庫(kù);并用G5-24表位多肽篩選特異噬菌體抗體,分析確定針對(duì)靶標(biāo)G5-24表位多肽的人源scFv基因.對(duì)篩選獲得的人源抗G5-24 scFv(VL-VH)基因進(jìn)行了重構(gòu),將它們克隆入表達(dá)載體pET22b(+)

3、中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá);對(duì)重組表達(dá)蛋白用Ni-NTA柱純化后,采用尿素梯度透析法進(jìn)行復(fù)性.對(duì)scFv(VH-VL)和scFv(VL-VH)的親和力和熱穩(wěn)定性進(jìn)行了初步檢測(cè).為了提高抗G5-24 scFv的穩(wěn)定性,應(yīng)用PCR定點(diǎn)突變的方法分別在VH第44位和VL第100位引入Cys,構(gòu)建抗G5-24 dsFv VH、VL基因,并將二者在原核表達(dá)系統(tǒng)PET-22b(+)/BL21(DE3)中分別表達(dá).dsFv的