利用滾環(huán)擴(kuò)增和納米粒子均相無標(biāo)記檢測核酸的研究.pdf

1、核酸及其單核苷酸多態(tài)性（SNP）的分析檢測在當(dāng)前生化研究和臨床診斷等領(lǐng)域具有重要的意義。開發(fā)簡便、快速、高靈敏和特異性好的均相無標(biāo)記的核酸和SNP的檢測新方法具有廣泛的應(yīng)用前景。論文主要應(yīng)用滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）和納米粒子探針技術(shù)，結(jié)合生物發(fā)光、分子熒光和共振光散射等檢測技術(shù)研究開發(fā)了系列均相無標(biāo)記檢測核酸和SNP的新方法，主要內(nèi)容如下：
　　 1、結(jié)合簡便、高效的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)和高靈敏的熒光蟲素生物發(fā)光反應(yīng)，建立了均相無標(biāo)記檢測SN

2、P的新方法。方法基于突變型DNA可特異的引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，應(yīng)用螢火蟲素生物發(fā)光反應(yīng)檢測滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的大量焦磷酸根。相對照，野生型DNA不能引發(fā)RCA反應(yīng)，根據(jù)二者生物發(fā)光信號的顯著差異，可實(shí)現(xiàn)突變型DNA的高靈敏度檢測和特異地區(qū)分單堿基差別，方法對突變型DNA的定量檢出限為0.45 pmol/L，可精確測定1％突變頻率。
　　 2、基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的原理，在滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)過程中，加入與滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的反向引物，該引物以滾環(huán)

3、擴(kuò)增產(chǎn)物為模板引發(fā)反向頂替支化擴(kuò)增，產(chǎn)生大量的單鏈和雙鏈的DNA產(chǎn)物，利用特異性的DNA檢測熒光染料SYBR Green I進(jìn)行熒光檢測，建立了滾環(huán)擴(kuò)增均相無標(biāo)記熒光法檢測SNP的新方法。根據(jù)突變型和野生型DNA產(chǎn)生的熒光信號差異，實(shí)現(xiàn)了1％突變頻率的特異性檢測和高靈敏的定量檢測突變型DNA，檢出限為8.6 fmol/L。
　　 3、應(yīng)用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)均相無標(biāo)記檢測微小RNA（miRNA）。方法以miRNA為模板使掛鎖探針特異性的

4、連接成環(huán)；然后以環(huán)形DNA探針為模板，miRNA直接作為引物引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)加入與RCA反應(yīng)產(chǎn)物互補(bǔ)的反向引物，引發(fā)支化擴(kuò)增，結(jié)果產(chǎn)生大量多種長度的單鏈和雙鏈的DNA產(chǎn)物，應(yīng)用特異性的DNA檢測熒光染料進(jìn)行定量。方法無需反轉(zhuǎn)錄步驟，操作簡便、靈敏度高、可特異性地檢測單堿基差別的miRNAs。
　　 4、制備了穩(wěn)定性好、便宜和生物兼容性好的氫氧化鐵納米粒子，通過靜電力作用，鐵納米粒子以DNA分子為模板進(jìn)行組裝聚集，應(yīng)用高靈敏