基于滾環(huán)DNA擴增和納米材料的生物傳感分析方法研究.pdf

1、隨著分析科學(xué)的不斷發(fā)展，生命科學(xué)領(lǐng)域中蛋白質(zhì)、核酸、酶活性以及生物小分子的相關(guān)信息越來越多地需要借助于生物傳感技術(shù)進(jìn)行分析和檢測取得。快速，準(zhǔn)確的獲取這些生命分子的信息對生物醫(yī)學(xué)，臨床診斷和治療具有非常巨大的意義。近年來，新的分子生物技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并在科學(xué)研究和實際應(yīng)用中得到不斷的發(fā)展和完善。然而，隨著醫(yī)學(xué)診斷水平的不斷提高和科學(xué)研究的持續(xù)深入，對生物分子檢測方法的要求也越來越高。開發(fā)一些高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確性、低成本、簡單快速的

2、定性或定量的分析方法以更好的滿足研究和實際應(yīng)用的需要成為分析化學(xué)科研工作者面臨的重大挑戰(zhàn)。本論文針對上述問題，基于滾環(huán)DNA擴增技術(shù)和新型納米材料發(fā)展了一系列高靈敏度、高特異性的生物分析方法用于酶活性、核酸、蛋白以及小分子檢測，并進(jìn)一步通過對實際樣品的分析，初步驗證了這些技術(shù)的可行性、可靠性以及準(zhǔn)確性。具體內(nèi)容如下:
　　人鳥嘌呤糖基化酶(hOGG1)由于具有修復(fù)DNA氧化損傷的能力而在維持生命體基因完整度上發(fā)揮著重要作用。hOG

3、G1的表達(dá)水平與很多包括癌癥在內(nèi)的疾病緊密相關(guān)。在第2章中，我們構(gòu)建了一種新穎的熒光“l(fā)ight-up”型的生物傳感器用于高靈敏檢測hOGG1活性。該方法的建立基于目標(biāo)物誘導(dǎo)形成5'端磷酸化探針和能夠產(chǎn)生自催化DNA酶的滾環(huán)擴增技術(shù)。該方法對hOGG1的檢測限可低至0.001 U/mL，如此低的靈敏度主要歸因于基本沒有增加的背景信號和我們構(gòu)建的雙信號放大策略。據(jù)我們所知，這是檢測堿基修復(fù)酶的方法中最靈敏的檢測方法之一。同時，該方法對可能

4、影響目標(biāo)物檢測的干擾酶體現(xiàn)出很好的特異性，在實際樣品的分析中有很大的應(yīng)用潛力。
　　單核苷酸多態(tài)性，是指基因組水平上單個核苷酸的變異，是最常見的遺傳變異類型。如果突變發(fā)生在遺傳基因的編碼區(qū)，可能會引起所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的改變，從而引起基因疾病的發(fā)生。發(fā)展高靈敏，高特異性的檢測方法用于單核苷酸多態(tài)性的檢測對產(chǎn)前基因診斷具有重要意義。在第3章中，我們利用EcoliDNA連接酶對單堿基錯配的高特異性識別能力，結(jié)合上一章的滾環(huán)擴增技

5、術(shù)和DNA酶循環(huán)放大技術(shù)構(gòu)建了一種高靈敏和高特異性檢測單核苷酸多態(tài)性的分析方法。掛鎖探針只能與完全互補的目標(biāo)DNA雜交后才能被Ecoli DNA連接酶連接成環(huán)，并引發(fā)級聯(lián)信號放大反應(yīng)。錯配的DNA與掛鎖探針不能發(fā)生完全雜交，EcoliDNA連接酶能夠識別不完全雜交的探針，因此，掛鎖探針不能連接成環(huán)形探針，進(jìn)而沒有級聯(lián)信號放大反應(yīng)的發(fā)生，檢測不到熒光信號。該分析方法對單核苷酸多態(tài)性具有很好的檢測性能，對目標(biāo)DNA檢測的線性范圍為0.01-

6、1 nM，檢測下限為2.6 pM。此外，由于DNA連接酶在連接位點對單堿基錯配的識別能力，該方法在野生型和突變型以不同比例混合的樣品中對突變型的DNA具有很好的特異性。
　　核酸內(nèi)切酶Ⅳ(EndoⅣ)，作為一種DNA修復(fù)酶，主要修復(fù)由脫堿基位點造成的DNA損傷，因此，在維持基因完整度方面發(fā)揮著重要作用。在第4章中，我們證明了EndoⅣ對單鏈DNA(sDNA)中脫嘌呤/脫嘧啶位點(AP)的裂解能力。我們發(fā)現(xiàn)，EndoⅣ對ssDNA中

7、的AP位點有很好的裂解能力相比于對雙鏈DNA中AP位點的酶切活性。進(jìn)一步地，我們利用EndoⅣ裂解ssDNA中AP位點性質(zhì)構(gòu)建了一種雙信號放大體系用于高靈敏檢測酶和蛋白的活性。雙信號放大體系主要是將核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)輔助的信號放大方法和滾環(huán)擴增技術(shù)結(jié)合起來。通過這樣的放大體系，我們構(gòu)建的分析方法具有良好的分析性能，對EndoⅣ的檢測下限可達(dá)0.008 U/mL，對鏈霉親和素(SA)的檢測下限可達(dá)2.5 pM。此外，該方法對其他可能

8、會有干擾的物質(zhì)表現(xiàn)出良好的特異性。本章提供了一種新的可用于酶和蛋白檢測的平臺，并有潛力在生物分析、疾病診斷和藥物發(fā)展方面找到更廣泛的應(yīng)用價值。
　　乙酰膽堿酯酶，是動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中很重要的一種關(guān)鍵酶，在阿茲海默疾病、炎癥和神經(jīng)毒性方面發(fā)揮著重要的功能。乙酰膽堿酯酶通過將乙酰膽堿水解成膽堿以維持神經(jīng)遞質(zhì)的水平。而乙酰膽堿酯酶的抑制劑，能夠使乙酰膽堿保持活躍狀態(tài)，并在體內(nèi)積累造成致命的后果。因此，測定乙酰膽堿酯酶活性和篩選其抑制劑具

9、有重大意義。在第5章中，利用聚T-DNA為模板合成的熒光銅納米顆粒，我們構(gòu)建了一種簡捷、高靈敏、高特異性的熒光分析方法用于乙酰膽堿酯酶及其抑制劑的檢測。該檢測方法利用硫代乙酰膽堿做為乙酰膽堿酯酶的底物，在乙酰膽堿酯酶的水解作用下，硫代乙酰膽堿被水解成硫代膽堿，硫代膽堿的自由的巰基可以和銅納米顆粒發(fā)生配位作用，進(jìn)而猝滅銅納米顆粒的熒光。該傳感器具有較好的分析性能，對乙酰膽堿酯酶的檢測范圍為0-5 mU/mL，檢測下限達(dá)0.026mU/mL

10、，并且對其他可能會干擾檢測的蛋白具有很好的特異性。此外，我們還用該傳感器進(jìn)行了乙酰膽堿酯酶抑制劑的檢測，有機磷殺蟲劑對氧磷為被選作抑制劑的模型進(jìn)行檢測，檢測機理主要是利用有機磷可以抑制乙酰膽堿酯酶對硫代乙酰膽堿的水解，進(jìn)而沒有硫代膽堿產(chǎn)物的生成，銅納米顆粒的熒光不會被猝滅。通過銅納米顆粒的熒光強度恢復(fù)信號實現(xiàn)對有機磷的檢測。該傳感器對對氧磷的檢測IC50值約為84 pg/mL。而且，我們還用該方法對實際樣品中加入的對氧磷進(jìn)行了檢測，獲得

11、了滿意的結(jié)果。本章的工作可能提供了一種在生物醫(yī)學(xué)和臨床應(yīng)用方面具有潛力的可用于酶及其抑制劑的分析傳感平臺。
　　目前，熒光納米顆粒由于其在標(biāo)記、傳感器、成像和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的前景受到了越來越多的關(guān)注。在第6章中，我們利用二氧化錳作為氧化劑用于合成熒光聚多巴胺納米顆粒。二氧化錳存在時，可以快速將多巴胺氧化成多巴醌，緊接著多巴醌通過自發(fā)聚合反應(yīng)形成熒光聚多巴胺納米顆粒。進(jìn)一步，利用熒光聚多巴胺納米顆粒作為指示劑，構(gòu)建了一種低成本、快