基于滾環(huán)擴增技術(shù)的沙門氏菌檢測生物傳感器.pdf

1、食源性致病菌對食物所引起的污染引發(fā)了對人類健康的危害，同時制約著國民經(jīng)濟的發(fā)展，當(dāng)今世界各國居民普遍被此問題所困擾。引起食物中毒的因素各種各樣，其中包括病毒、細菌、真菌等，在以細菌作為感染源的食物中毒事件中，大腸桿菌和沙門氏菌是最主要的兩類致病菌。隨著沙門氏菌對人們的危害愈加增長，食品安全問題愈加引起人們的關(guān)注，越來越多的科學(xué)家和學(xué)者致力于沙門氏菌的研究與檢測。常見的研究方法有微生物檢測法、分子生物學(xué)檢測法、儀器分析法、免疫學(xué)檢測法等等

2、，但由于這些檢測方法都或多或少的存在一些缺陷。本研究詳細介紹了鼠傷寒沙門氏菌的危害及常用的檢測方法。核酸適配體的特點、功能與應(yīng)用。滾環(huán)擴增技術(shù)的特點以及在生物傳感器中的應(yīng)用，并對適配體生物傳感器做了相關(guān)的改進，用于檢測鼠傷寒沙門氏菌?；诂F(xiàn)存的問題檢測效率低、靈敏度低和檢測限高的背景下，本研究以核酸適配體為識別元件，通過滾環(huán)擴增技術(shù)構(gòu)建兩種用于沙門氏菌檢測熒光生物傳感器，創(chuàng)新性在于將滾環(huán)擴增技術(shù)耦合DNA酶實現(xiàn)信號放大，制備的銀簇，通過

3、其極強的熒光信號實現(xiàn)了超靈敏檢測沙門氏菌。
　　本論文研究內(nèi)容如下：
　　第一部分：該方案設(shè)計了一種簡單的，成本低而且檢測速度非?？斓姆椒ㄓ脕砀咝У剡x擇并檢測鼠傷寒沙門氏菌。這種方法是基于核酸適配體對鼠傷寒沙門氏菌的特異性的識別與捕獲能力，結(jié)合滾環(huán)擴增技術(shù)構(gòu)建了超靈敏檢測鼠傷寒沙門氏菌的熒光生物傳感器。在本實驗里，成功設(shè)計了一個拱形探針，拱形部分是核酸適配體的堿基序列，互補鏈?zhǔn)且l(fā)滾環(huán)擴增的引物。當(dāng)體系中有目標(biāo)物存在時，拱形

4、探針的核酸適配體部分通過構(gòu)象變換并捕獲目標(biāo)物，導(dǎo)致引物得以釋放。在體系中加入掛鎖探針（Padlock）與T4 DNA連接酶以后，在引物的作用下，掛鎖探針與引物通過堿基互補配對結(jié)合在一起，在T4 DNA連接酶的作用下連接成環(huán)。體系中加入dNTP和phi29 DNA聚合酶以及BSA和phi29 DNA緩沖溶液等，就會順利實現(xiàn)滾環(huán)擴增過程，產(chǎn)生一條很長的，并且有無數(shù)個相同片段的DNA單鏈，這些單元與兩端分別修飾熒光基團 FAM和猝滅基團的發(fā)夾

5、結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而打開發(fā)夾。發(fā)夾的序列包含限制性內(nèi)切酶的切割位點，當(dāng)發(fā)夾結(jié)合到滾環(huán)擴增產(chǎn)生的DNA長鏈上時，限制性內(nèi)切酶會將發(fā)夾切斷，由于結(jié)合堿基太少，剪斷的發(fā)夾從長鏈上掉下來，一方面使得熒光釋放，產(chǎn)生很強的熒光信號，另一方面長鏈可以循環(huán)使用，達到信號放大的功效。在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中，此生物傳感器可以超靈敏檢測鼠傷寒沙門氏菌，最低檢測限是7.8 cfu/mL，而且檢測范圍是四個數(shù)量級。此外，該生物傳感器對鼠傷寒沙門氏菌表現(xiàn)出了非常高的選擇性，而且

6、具有成本低、檢測速度快、操作簡單等優(yōu)點，最重要的是，這種生物傳感器可以應(yīng)用于奶粉中鼠傷寒沙門試劑的檢測。
　　第二部分：該方案將銀簇引入滾環(huán)復(fù)制擴增技術(shù)，構(gòu)建了一個簡單的，無標(biāo)簽，成本低的方法用來高效地篩選并檢測鼠傷寒沙門氏菌。該方案通過滾環(huán)擴增放大技術(shù)完成銀簇模板的指數(shù)倍擴增，并利用銀簇自身產(chǎn)生熒光信號的特性，實現(xiàn)沙門氏菌的高靈敏檢測。方案所設(shè)計的發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括鼠傷寒沙門氏菌的適配體和一段引物，這段引物可以與含有一個銀簇單元的掛鎖

7、探針堿基互補配對，用來識別鼠傷寒沙門氏菌并引發(fā)指數(shù)增長的滾環(huán)擴增放大。掛鎖探針是由銀簇單元與內(nèi)切酶剪切位點組成。由于指數(shù)型滾環(huán)擴增放大和DNA酶信號放大技術(shù)的使用，當(dāng)體系存在鼠傷寒沙門氏菌的時候會導(dǎo)致發(fā)夾打開，適配體識別并捕獲鼠傷寒沙門氏菌，從而使得引物部分暴露出來進而引物與掛鎖探針結(jié)合，體系中加入dNTP和DNA聚合酶就能產(chǎn)生無數(shù)個相同的單元，這些單元被限制性內(nèi)切酶切割成段，體系中加入硝酸銀和硼氫化鈉后，就會產(chǎn)生大量銀簇，可以檢測到非