基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)生物傳感器.pdf

1、食源性致病菌對(duì)食物所引起的污染引發(fā)了對(duì)人類(lèi)健康的危害，同時(shí)制約著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，當(dāng)今世界各國(guó)居民普遍被此問(wèn)題所困擾。引起食物中毒的因素各種各樣，其中包括病毒、細(xì)菌、真菌等，在以細(xì)菌作為感染源的食物中毒事件中，大腸桿菌和沙門(mén)氏菌是最主要的兩類(lèi)致病菌。隨著沙門(mén)氏菌對(duì)人們的危害愈加增長(zhǎng)，食品安全問(wèn)題愈加引起人們的關(guān)注，越來(lái)越多的科學(xué)家和學(xué)者致力于沙門(mén)氏菌的研究與檢測(cè)。常見(jiàn)的研究方法有微生物檢測(cè)法、分子生物學(xué)檢測(cè)法、儀器分析法、免疫學(xué)檢測(cè)法等等

2、，但由于這些檢測(cè)方法都或多或少的存在一些缺陷。本研究詳細(xì)介紹了鼠傷寒沙門(mén)氏菌的危害及常用的檢測(cè)方法。核酸適配體的特點(diǎn)、功能與應(yīng)用。滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)以及在生物傳感器中的應(yīng)用，并對(duì)適配體生物傳感器做了相關(guān)的改進(jìn)，用于檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌?；诂F(xiàn)存的問(wèn)題檢測(cè)效率低、靈敏度低和檢測(cè)限高的背景下，本研究以核酸適配體為識(shí)別元件，通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)構(gòu)建兩種用于沙門(mén)氏菌檢測(cè)熒光生物傳感器，創(chuàng)新性在于將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)耦合DNA酶實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，制備的銀簇，通過(guò)

3、其極強(qiáng)的熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)了超靈敏檢測(cè)沙門(mén)氏菌。
　　本論文研究?jī)?nèi)容如下：
　　第一部分：該方案設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單的，成本低而且檢測(cè)速度非常快的方法用來(lái)高效地選擇并檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌。這種方法是基于核酸適配體對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的特異性的識(shí)別與捕獲能力，結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)構(gòu)建了超靈敏檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的熒光生物傳感器。在本實(shí)驗(yàn)里，成功設(shè)計(jì)了一個(gè)拱形探針，拱形部分是核酸適配體的堿基序列，互補(bǔ)鏈?zhǔn)且l(fā)滾環(huán)擴(kuò)增的引物。當(dāng)體系中有目標(biāo)物存在時(shí)，拱形

4、探針的核酸適配體部分通過(guò)構(gòu)象變換并捕獲目標(biāo)物，導(dǎo)致引物得以釋放。在體系中加入掛鎖探針（Padlock）與T4 DNA連接酶以后，在引物的作用下，掛鎖探針與引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合在一起，在T4 DNA連接酶的作用下連接成環(huán)。體系中加入dNTP和phi29 DNA聚合酶以及BSA和phi29 DNA緩沖溶液等，就會(huì)順利實(shí)現(xiàn)滾環(huán)擴(kuò)增過(guò)程，產(chǎn)生一條很長(zhǎng)的，并且有無(wú)數(shù)個(gè)相同片段的DNA單鏈，這些單元與兩端分別修飾熒光基團(tuán) FAM和猝滅基團(tuán)的發(fā)夾

5、結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而打開(kāi)發(fā)夾。發(fā)夾的序列包含限制性?xún)?nèi)切酶的切割位點(diǎn)，當(dāng)發(fā)夾結(jié)合到滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA長(zhǎng)鏈上時(shí)，限制性?xún)?nèi)切酶會(huì)將發(fā)夾切斷，由于結(jié)合堿基太少，剪斷的發(fā)夾從長(zhǎng)鏈上掉下來(lái)，一方面使得熒光釋放，產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)，另一方面長(zhǎng)鏈可以循環(huán)使用，達(dá)到信號(hào)放大的功效。在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中，此生物傳感器可以超靈敏檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌，最低檢測(cè)限是7.8 cfu/mL，而且檢測(cè)范圍是四個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，該生物傳感器對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出了非常高的選擇性，而且

6、具有成本低、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，最重要的是，這種生物傳感器可以應(yīng)用于奶粉中鼠傷寒沙門(mén)試劑的檢測(cè)。
　　第二部分：該方案將銀簇引入滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)簡(jiǎn)單的，無(wú)標(biāo)簽，成本低的方法用來(lái)高效地篩選并檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌。該方案通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增放大技術(shù)完成銀簇模板的指數(shù)倍擴(kuò)增，并利用銀簇自身產(chǎn)生熒光信號(hào)的特性，實(shí)現(xiàn)沙門(mén)氏菌的高靈敏檢測(cè)。方案所設(shè)計(jì)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括鼠傷寒沙門(mén)氏菌的適配體和一段引物，這段引物可以與含有一個(gè)銀簇單元的掛鎖

7、探針堿基互補(bǔ)配對(duì)，用來(lái)識(shí)別鼠傷寒沙門(mén)氏菌并引發(fā)指數(shù)增長(zhǎng)的滾環(huán)擴(kuò)增放大。掛鎖探針是由銀簇單元與內(nèi)切酶剪切位點(diǎn)組成。由于指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增放大和DNA酶信號(hào)放大技術(shù)的使用，當(dāng)體系存在鼠傷寒沙門(mén)氏菌的時(shí)候會(huì)導(dǎo)致發(fā)夾打開(kāi)，適配體識(shí)別并捕獲鼠傷寒沙門(mén)氏菌，從而使得引物部分暴露出來(lái)進(jìn)而引物與掛鎖探針結(jié)合，體系中加入dNTP和DNA聚合酶就能產(chǎn)生無(wú)數(shù)個(gè)相同的單元，這些單元被限制性?xún)?nèi)切酶切割成段，體系中加入硝酸銀和硼氫化鈉后，就會(huì)產(chǎn)生大量銀簇，可以檢測(cè)到非