寵物烏龜沙門氏菌PCR檢測方法的建立.pdf

1、沙門氏菌(Salmonella)是一大群寄生于人類和動物腸道內(nèi)的革蘭氏陰性桿菌,不僅能導(dǎo)致動物疾病,還能使人類發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、腸胃炎等疾病。國外曾發(fā)生過嚴(yán)重的龜源性沙門氏菌感染人的事件。隨著烏龜作為寵物飼養(yǎng)的數(shù)量不斷提高,龜源性沙門氏菌在中國也越來越存在著潛在的公共衛(wèi)生的威脅。本研究旨在建立一種檢測寵物烏龜沙門氏菌的PCR的方法。
　　 本研究的試驗(yàn)樣本來自于2008年7月至2009年8月期間到中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院就診

2、及學(xué)校附近的花鳥市場的烏龜,共64只,所選病例要求未使用過抗生素。按照世界衛(wèi)生組織(WHO)及國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)推薦的沙門氏菌檢測方法對分離培養(yǎng)的每株細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定。然后對鑒定后的細(xì)菌用K-B瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果:檢測64只烏龜,18只龜檢出攜帶沙門氏菌,沙門氏菌的攜帶率為28.1％。其中家養(yǎng)寵物烏龜44只,5只檢出攜帶沙門氏菌,攜帶率為11.3％;另外20只烏龜采自花鳥市場,13只檢出攜帶沙門氏菌,沙門氏菌攜帶率為

3、65％。藥敏試驗(yàn)結(jié)果:寵物烏龜沙門氏菌的耐藥性比較嚴(yán)重,對某些常用抗生素的耐藥性高達(dá)70％以上:氨芐西林(74％)、四環(huán)素(79％)、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶(70％)。對克拉維酸/阿莫西林不敏感(37％)。沙門氏菌對頭孢曲松、阿米卡星、頭孢噻吩及恩諾沙星的敏感性高達(dá)99％,可以作為臨床治療的首選藥物。
　　 本研究首次建立寵物烏龜沙門氏菌PCR檢測方法并應(yīng)用于臨床樣品。根據(jù)沙門氏菌屬invA基因序列設(shè)計(jì)一對引物,建立用于檢測寵物烏

4、龜沙門氏菌的PER方法。結(jié)果:對購買的標(biāo)準(zhǔn)菌株和7種非沙門氏菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,標(biāo)準(zhǔn)沙門氏菌擴(kuò)增出372bp的特異性條帶,非沙門氏菌菌株未擴(kuò)增出任何條帶。通過電泳判定結(jié)果,該法可檢出體系最低擴(kuò)增2.4×102cfu/ml的沙門氏菌說明該方法敏感性高。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序證實(shí)為invA基因,與對比序列具有非常高的同源性,說明該P(yáng)CR檢測方法具有較高的特異性。對來自動物醫(yī)院及花鳥市場的230個(gè)細(xì)菌菌株進(jìn)行檢測,檢測出135個(gè)烏龜沙門氏菌陽性樣