腸炎沙門氏菌的分離鑒定與特異性檢測(cè)方法的建立.pdf

1、沙門氏菌屬于腸桿菌科細(xì)菌,由此類細(xì)菌引起的各種動(dòng)物疾病稱為沙門氏菌病,除初生動(dòng)物,人畜感染后一般呈無癥狀帶菌狀態(tài),長期排菌,污染肉蛋產(chǎn)品,同時(shí)它們也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病,可能加重病情或者增加死亡率,或者降低動(dòng)物生產(chǎn)力等,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益影響重大。目前,雞腸炎沙門氏菌污染禽蛋肉產(chǎn)品在全球范圍內(nèi)已是很嚴(yán)重的食品衛(wèi)生問題。日、美等發(fā)達(dá)國家發(fā)生的食物中毒事件中很多都是由沙門氏菌引起的,腸炎沙門氏菌感染漸漸超越鼠傷寒沙門氏菌成為其最主要

2、的病原菌。腸炎沙門氏菌引起雞群發(fā)病的癥狀和病理學(xué)變化與雞白痢沙門氏菌非常相似,所以在生產(chǎn)中常常把雞源腸炎沙門氏菌感染癥誤診為雞白痢或傷寒。但是腸炎沙門氏菌的貯藏宿主譜比白痢沙門氏菌廣泛,該病的防治和普查要比雞白痢困難得多,建立腸炎沙門氏菌快速特異性檢測(cè)方法在養(yǎng)殖業(yè),醫(yī)學(xué)以及公共衛(wèi)生界有重要意義。本研究中不僅成功從臨床發(fā)病雞場(chǎng)成功分離到腸炎沙門氏菌致病株,并根據(jù)腸炎沙門氏菌獨(dú)特的染色體基因序列建立PCR方法特異性檢測(cè)腸炎沙門氏菌,根據(jù)腸炎

3、沙門氏菌獨(dú)特的表面菌毛抗原蛋白建立間接ELISA方法特異性檢測(cè)腸炎沙門氏菌感染血清。
　　 1腸炎沙門氏菌的分離與鑒定
　　 從江蘇某發(fā)病雞場(chǎng)發(fā)病死亡雛雞體內(nèi)分離出1株細(xì)菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生化特性、血清學(xué)鑒定以及PCR鑒定,該菌株被鑒定為D群沙門氏菌-腸炎沙門氏菌,并命名為GY09。動(dòng)物試驗(yàn)表明,該株細(xì)菌以1×109cfu劑量腹腔注射小鼠,試驗(yàn)組小鼠在72小時(shí)內(nèi)全部死亡,以1×109cfu皮下注射3日齡SPF雛雞,雛雞在

4、48小時(shí)內(nèi)全部死亡;而以3×109cfu劑量皮下注射17日齡SPF雞,試驗(yàn)組雞在3周試驗(yàn)期內(nèi)全部存活。藥物敏感性試驗(yàn)表明,該株細(xì)菌已對(duì)革蘭氏陰性菌感染適用的常規(guī)藥物,如環(huán)丙沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、鏈霉素等產(chǎn)生完全耐藥性,而對(duì)青霉素和頭孢類藥物保持較高敏感性。本試驗(yàn)研究表明,腸炎沙門氏菌早期感染是雛雞高死亡率的一種重要病因。
　　 2腸炎沙門氏菌SEF14菌毛的抽提、純化及生物學(xué)活性檢測(cè)
　　 腸炎沙門氏菌在適合的體外培養(yǎng)

5、條件下,抽提和純化SEF14菌毛蛋白并進(jìn)行生物學(xué)活性的檢測(cè)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌在CFA培養(yǎng)液中,靜止培養(yǎng)50h左右,SEF14菌毛表達(dá)量相對(duì)較多,在機(jī)械高速勻漿后,菌體表面菌毛脫落后經(jīng)進(jìn)一步的透析純化,從而得到較純的SEF14菌毛蛋白,蛋白大小和相關(guān)報(bào)道一致,約14KDa左右。Western-blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純化的重組蛋白rSEFA(體外表達(dá)的SEF14菌毛主要亞單位蛋白SEFA)免疫小鼠得到的高免血清能識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)株腸炎沙門氏

6、菌SEFl4菌毛蛋白以及純化的重組蛋白rSEFA,說明體外表達(dá)的rSEFA蛋白和體外抽提的SEF14菌毛蛋白一樣有較好的免疫原性和反應(yīng)原性。
　　 3腸炎沙門氏菌特異性檢測(cè)方法的建立
　　 本試驗(yàn)部分建立和優(yōu)化了PCR方法特異性檢測(cè)腸炎沙門氏菌以及重組蛋白rSEFA介導(dǎo)的間接ELISA方法特異性檢測(cè)腸炎沙門氏菌血清抗體。Sdf1為腸炎沙門氏菌特有的一段基因,設(shè)計(jì)一對(duì)引物特異性檢測(cè)腸炎沙門氏菌,以此PCR方法能成功檢測(cè)2株

7、腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株,5株不同來源腸炎沙門氏菌臨床分離株,而相同PCR條件下不能從都柏林沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等其他沙門氏菌和其他同屬腸桿菌科的常見致病菌染色體上擴(kuò)增相應(yīng)片段;本試驗(yàn)部分確定了間接ELISA方法抗原最佳包被量為7.5μg/ml,血清最適稀釋度1:100,作用時(shí)間為60min;酶標(biāo)二抗最適稀釋度為1:4000,作用時(shí)間為60min;判定標(biāo)準(zhǔn)為0D值≥0.346,基于rSEFA介導(dǎo)的間接ELISA有較好的特異