基于CRISPR序列的沙門氏菌分子分型方法的建立.pdf

1、沙門氏菌（Salmonella）是引發(fā)食物中毒的主要食源性致病菌之一，其中腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）是全球范圍內(nèi)最重要的沙門氏菌血清型之一。開展沙門氏菌分子分型工作，能夠揭示菌株的來源、變異和進(jìn)化規(guī)律，為沙門氏菌危害溯源、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和危害控制提供數(shù)據(jù)支撐，對(duì)追蹤和監(jiān)測(cè)致病菌的傳播和疫情暴發(fā)具有重要意義。
　　本研究以規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(Clustered

2、Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)為基礎(chǔ)，研究了CRISPR的結(jié)構(gòu)和功能及不同血清型CRISPR間隔序列差異，并基于快速、有效、成本低、簡(jiǎn)單化的原則，提出了兩種新型的CRISPR分型方法即 CSST（CRISPR initial three Spacers Sequence Typing）和TCSST（Target and CRISPR initial thre

3、e Spacers Sequence Typing），將這兩種分型方法應(yīng)用于沙門氏菌分子分型實(shí)踐中，對(duì)其進(jìn)行應(yīng)用評(píng)估。
　　本研究首先根據(jù) CRISPR1及 CRISPR2上下游保守序列分別設(shè)計(jì)了擴(kuò)增不同沙門氏菌血清型的CRISPR1引物及 CRISPR2引物，至少可以應(yīng)用于30種沙門氏菌血清型的分子分型，并繪制了這30種CRISPR1與CRISPR2間隔序列圖譜。另外，從S9、S45、S69、S87、S95、S121、S165和

4、S200等8個(gè)沙門氏菌屬特異性靶點(diǎn)中篩選出了聚類分型效果最佳的S69，在有需要進(jìn)一步提高分辨力時(shí)納入CSST分型體系中，構(gòu)建TCSST分子分型方法，作為對(duì)CSST分型缺陷的有力補(bǔ)充。
　　隨后，利用傳統(tǒng)CRISPR分型、S69分型、CSST及TCSST等四種分型方法分別對(duì)30種沙門氏菌血清型共86株菌進(jìn)行分型探究，區(qū)分度（辛普森指數(shù)，D值）分別為0.9692、0.8902、0.9199和0.9423，說明四種方法對(duì)不同血清型沙門氏

5、菌都具有良好的分辨力，其中以傳統(tǒng) CRISPR分型最佳，TCSST次之。CSST分型至少可以將21種血清型分開，優(yōu)于S69分型，在將更多的血清型分開的同時(shí)對(duì)同種血清型的菌株也有一定的分辨力，如把傷寒沙門氏菌分成兩支，把鼠傷寒沙門氏菌分成3個(gè)分支，而且 CSST只需要分析 CRISPR1/CRISPR2的三個(gè)間隔序列，比傳統(tǒng)的CRISPR分型更加簡(jiǎn)便，測(cè)序成本低，只需要上游序列即可，因此CSST可用于對(duì)不同沙門氏菌血清型的快速、有效的甄別

6、。
　　此外，本研究將毒力基因分型、ERIC-PCR分型、傳統(tǒng)CRISPR分型、CLSPT分型、CSST分型和TCSST分型等六種方法同時(shí)應(yīng)用于2008-2012年90株不同來源的腸炎沙門氏菌分離株的分型，分別可以得到7、1、6、1、4和12個(gè)基因型，D值分別為0.4092、0、0.1293、0、0.0871和0.7506，以TCSST法的分型效果最佳，將菌株數(shù)量增加到198株時(shí)，可分31個(gè)TCSST型，區(qū)分值為0.6555，對(duì)腸

7、炎沙門氏菌仍有一定應(yīng)用分型價(jià)值。而且，TCSST型與菌株的來源及年份有一定的相關(guān)性，同時(shí)探討了TCSST型與毒力基因的關(guān)系。另外，腸炎沙門氏菌分離株數(shù)目增加到198株時(shí)，可分為31個(gè)TCSST，區(qū)分度為0.6555，TCSST對(duì)腸炎沙門氏菌仍有一定的分辨力。
　　綜上，本研究 CSST分型方法在不同沙門氏菌血清型菌株分型應(yīng)用中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，只需要分析部分間隔序列，因此具有操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)納入特異性靶點(diǎn)S69后建立