核酸染料-qPCR技術(shù)檢測(cè)腸炎沙門氏菌方法的研究.pdf

1、沙門氏菌屬(SalmonellaLignieres)是日常生活中最為常見且危害較為嚴(yán)重的食源性致病菌之一，屬于革蘭氏陰性腸道桿菌(Gram-negative)。而在大多數(shù)由沙門氏菌引起的中毒事件的主要病原菌為腸炎沙門氏菌。它會(huì)造成人類傷寒、腸胃炎、感染性腹瀉、發(fā)熱及嘔吐等狀況。
　　常規(guī)的食品中的沙門氏菌檢測(cè)根據(jù)現(xiàn)行的國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2010規(guī)定，大致分為細(xì)菌分離、培養(yǎng)與鑒定三個(gè)部分。其檢測(cè)程序包括前增菌、增菌、分離、生

2、化鑒定及血清學(xué)鑒定5個(gè)步驟，一般需耗時(shí)4～7天，檢測(cè)周期較長(zhǎng)。同時(shí)對(duì)于可疑菌落的篩選也多倚賴檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)，存在一定的不確定性。為了適應(yīng)食品行業(yè)高速發(fā)展的現(xiàn)狀、滿足食品安全檢驗(yàn)快速準(zhǔn)確的要求，我們亟需新的檢驗(yàn)技術(shù)手段，來(lái)監(jiān)察和控制沙門氏菌的傳播，保證人們?nèi)粘Ｉ罟ぷ鞯慕】甸_展。
　　PCR技術(shù)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，在多個(gè)科研領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用和深入探索。PCR技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中也有較多成功的應(yīng)用實(shí)例。但該方法也面臨著巨大的技

3、術(shù)挑戰(zhàn):由于細(xì)菌的DNA有較高的穩(wěn)定性，菌體死后其DNA仍可以作為PCR擴(kuò)增的模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR方法只能檢測(cè)樣品中是否含有目標(biāo)片段，無(wú)法對(duì)目標(biāo)的存在狀態(tài)提供準(zhǔn)確的信息，無(wú)選擇性擴(kuò)增從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。因此，PCR技術(shù)在檢測(cè)食源性致病菌上有較大的限制，無(wú)法作為最主要的致病菌檢測(cè)方法。如果得到陽(yáng)性結(jié)果，依舊需要傳統(tǒng)方法做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
　　本實(shí)驗(yàn)以腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)菌株(ATCC1

4、3076)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，使用DNA染料EMA（EdthidiumMonoazideBromide疊氮溴化乙啶）和PMA(PropidiumMonoazideBromide疊氮溴化丙啶)預(yù)處理細(xì)菌，并與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timeQuantitativePCR)技術(shù)相結(jié)合，抑制死細(xì)菌的DNA擴(kuò)增，有選擇擴(kuò)增活細(xì)菌的DNA，實(shí)現(xiàn)區(qū)分活/死細(xì)菌的目的。EMA與PMA都是核酸染料，國(guó)內(nèi)外研究表明他們都具有滲透破損細(xì)胞并與DNA結(jié)合的特性

5、，同時(shí)對(duì)于細(xì)胞壁完好的活菌的擴(kuò)增反應(yīng)影響較小，從而克服PCR技術(shù)無(wú)法區(qū)別活/死菌的缺點(diǎn)，降低PCR檢測(cè)技術(shù)的假陽(yáng)性率。
　　本研究發(fā)現(xiàn)，使用EMA處理濃度為5×107CFU/mL的腸炎沙門氏菌，在分別進(jìn)行了純培養(yǎng)腸炎沙門氏菌菌液檢測(cè)和實(shí)際樣品加標(biāo)培養(yǎng)檢測(cè)兩部分實(shí)驗(yàn)后，得到以下結(jié)果:
　　(1)在生理鹽水中，腸炎沙門氏菌的檢出限為104CFU/mL。繼續(xù)增菌培養(yǎng)6h后，可以檢出初始濃度為101CFU/mL的腸炎沙門氏菌菌懸液;

6、當(dāng)延長(zhǎng)增菌時(shí)間24h后，可檢出的初始菌液的濃度提高到100CFU/mL。
　　(2)在純菌培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)中，使用濃度為10μg/mL的EMA，經(jīng)過(guò)10min的暗室反應(yīng)，于500w鹵素?zé)粝缕毓?5min的實(shí)驗(yàn)條件可以實(shí)現(xiàn)完全抑制死細(xì)胞DNA擴(kuò)增的效果(Ct值＞40)，同時(shí)該濃度對(duì)于低濃度的活細(xì)胞的擴(kuò)增無(wú)明顯影響，與對(duì)照組差異不顯著(p＞0.05)，不會(huì)影響最終定性檢測(cè)的結(jié)果。
　　(3)PMA針對(duì)相同濃度的腸炎沙門氏菌菌懸液，其對(duì)

7、死菌的抑制效果并不理想。調(diào)節(jié)染料濃度和曝光時(shí)間也無(wú)法達(dá)到完全抑制死菌擴(kuò)增的目標(biāo)。這個(gè)結(jié)果表明，就腸炎沙門氏菌而言，EMA與PMA兩種試劑的作用條件、效果并不相同，染料EMA是效果更好的死菌擴(kuò)增的抑制劑。
　　(4)根據(jù)純菌液實(shí)驗(yàn)部分所得結(jié)論建立實(shí)驗(yàn)體系，在實(shí)際樣品的實(shí)驗(yàn)部分，驗(yàn)證染料EMA的作用效果。分別選取凍羊肉、鮮凍禽（雞肉）、鮮雞蛋（蛋液）3種樣品進(jìn)行了加標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證明，使用濃度為10μg/mL的EMA，經(jīng)過(guò)10min