滾環(huán)擴增技術檢測miR-21的方法學研究.pdf

1、第一部分利用超分支滾環(huán)擴增技術檢測miR-21
　　目的:利用超分支滾環(huán)擴增(hyper-rolling cycleamplification，HRCA)技術建立一種檢測microRNA的方法。
　　方法:1.以miR-21為研究對象，根據(jù)miR-21的堿基序列(來源于miRbase)設計特異的逆轉(zhuǎn)錄引物及鎖式探針。2.建立檢測miR-21的支鏈滾環(huán)擴增技術，步驟如下:miR-21逆轉(zhuǎn)錄出cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應;鎖式探針環(huán)化的

2、連接反應;對已環(huán)化的探針進行擴增反應。3.對超分支滾環(huán)擴增反應條件進行優(yōu)化，包括:鎖式探針最適濃度，鎖式探針連接時間，擴增反應時間。4.通過對不同濃度的模板及不同的microRNA進行檢測來研究本方法的靈敏度和特異性。
　　結(jié)果:通過對反應條件進行優(yōu)化，100nM的鎖式探針在Taq DNA連接酶作用下46℃連接30min，Bst DNA聚合酶作用下60℃反應50min，可實現(xiàn)靶序列最大效率的擴增。該方法特異性好，最低檢測濃度為10

3、pM。
　　結(jié)論:超分支滾環(huán)擴增技術靈敏度高、特異性好、無需特殊昂貴儀器且簡單易操作，能夠應用于microRNA的檢測。
　　第二部分滾環(huán)擴增技術聯(lián)合DNA芯片檢miR-21
　　目的:將滾環(huán)擴增技術與DNA芯片技術結(jié)合起來，建立一種檢測microRNA的固相檢測技術。
　　方法:1.以miR-21為研究對象，根據(jù)鎖式探針與模板結(jié)合的特異性堿基序列外的連接序列設計捕獲探針，用于醛基化玻片的包被。2.通過人工合成的

4、用生物素標記的捕獲探針的互補探針與捕獲探針的雜交反應來驗證所設計的捕獲探針是否能成功固定在醛基片上，并且檢測出捕獲探針的濃度為多大時固定效果最佳。3.建立檢測miR-21的芯片檢測技術，步驟如下:捕獲探針的固定，已環(huán)化的鎖式探針與捕獲探針的雜交，擴增反應，生物素標記探針與RCA產(chǎn)物的雜交，親和素標記的納米金與生物素標記的產(chǎn)物雜交，顯色反應。4.反應條件的優(yōu)化，包括:捕獲探針最適固定濃度，捕獲探針最適反應濃度，環(huán)化探針與捕獲探針最適雜交反

5、應溫度，環(huán)化探針與捕獲探針最適反應時間。5.通過對不同濃度的模板及不同的microRNA進行檢測來研究本方法的靈敏度和特異性。
　　結(jié)果:人工設計的生物素標記的捕獲探針的互補探針與預先設計好的并已經(jīng)按照一定濃度倍比稀釋并準確點樣于醛基片上預先設計好的點樣點的捕獲探針進行雜交反應，各捕獲探針固定位點均明顯呈現(xiàn)陽性反應并且顏色深淺按照點樣濃度梯度呈一致性變化，證明我們所設計的探針準確，并且發(fā)現(xiàn)捕獲探針的最佳固定濃度為5μM。通過對反應