基于滾環(huán)擴增技術的低豐度蛋白質(zhì)檢測.pdf

1、目的:
　　蛋白質(zhì)是人體中重要的大分子化合物，高靈敏的蛋白質(zhì)檢測在疾病的臨床診斷和治療具有重要意義。因為許多少數(shù)重要的蛋白質(zhì)足以影響到細胞生物學功能并觸發(fā)病理生理過程。然而，由于許多蛋白質(zhì)分子在體內(nèi)的濃度很低，因此，低豐度蛋白的檢測過程中的信號放大是一個關鍵問題。本文結合滾環(huán)擴增(rolling circle amplificationRCA)技術建立一種低豐度蛋白質(zhì)的高通量檢測方法，并將其用于血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascula

2、r endothelial growth factor，VEGF）的檢測。
　　方法:
　　結合了靈敏度高和特異性強的滾環(huán)擴增(rolling circleamplification，RCA)技術和抗原-抗體免疫反應，設計出了一種聯(lián)級信號擴增方法，以實現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)的超靈敏檢測。利用VEGF免疫試劑盒，以鏈酶親和素為橋梁，生物素修飾的單鏈寡核苷酸引物可以高親和力地連接到生物素標記的免疫復合物上，建立低豐度蛋白質(zhì)的檢測平臺，通

3、過RCA擴增形成大量的重復序列可以作為優(yōu)良的模板，單鏈DNA分子上串聯(lián)重復序列的每個單元均可與一個生物標記的雜交探針互補雜交，從而有利于鏈親和素-辣根過氧化物的有序組裝，進而實現(xiàn)信號的放大。
　　結果:
　　經(jīng)過不斷優(yōu)化實驗條件，對VEGF檢測的靈敏度達到10fM。與常規(guī)的酶標二抗體系ELISA法相比，本方法具有更高的靈敏度，適于低豐度蛋白質(zhì)的檢測。
　　結論:
　　本研究所建立的滾環(huán)擴增策略具有很強的信號放大能