表面等離子技術(shù)結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增法檢測(cè)丙型肝炎病毒.pdf

1、研究背景和目的:
　　 目前常規(guī)檢測(cè)丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的方法主要包括核心抗原檢測(cè)、抗體檢測(cè)以及核酸檢測(cè)。多年以來，很多研究試圖建立血液中各種HCV抗原抗體以及核酸的檢測(cè)方法，但由于人體血液中HCV抗原抗體及核酸含量過低，用這些常規(guī)方法有時(shí)會(huì)無法檢測(cè)出HCV。
　　 HCV核心抗原檢測(cè)方法主要是用雙抗體夾心法檢測(cè)人體血清中的丙型肝炎核心抗原，該方法的基本步驟是:用基因工程制備核心抗原

2、進(jìn)行小鼠免疫后獲得純抗HCV核心抗原的單抗作為固相包被物，配合使用辣根過氧化物酶標(biāo)記物的2抗，與血清中的HCV核心抗原反應(yīng)，顯色后進(jìn)行定性或定量測(cè)定。該方法檢測(cè)具有延后性，而且靈敏度不高。
　　 另外一種檢測(cè)HCV的方法是將HCV病毒經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過PCR將cDNA擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。但是由于血液中的 RNA濃度低，有時(shí)并不能檢測(cè)到HCV的 RNA，所以傳統(tǒng)的方法不能滿足丙肝病人的血清或者分泌物中極低濃度的RNA檢測(cè)。

3、r>　　 近年來，表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)已逐步成為研究和識(shí)別生物活性材料親和力作用的主要方法之一。SPR傳感器已逐步應(yīng)用到分析抗原抗體反應(yīng)、觀察DNA的雜交、診斷細(xì)菌和病毒引起的疾病和觀察血液凝固等。SPR傳感器之所以能夠?qū)⒕哂邢嗨苹瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的混合物區(qū)分開，是因?yàn)镾PR能夠識(shí)別這些分析物，并且這些分析物能夠和固定在SPR傳感器表面上的生物活性物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)。SPR傳感器還可以免標(biāo)

4、記、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析物和活性物質(zhì)之間發(fā)生的反應(yīng)。SPR傳感器不僅可以監(jiān)測(cè)固定在材料上的分析物，還可以分析經(jīng)過解離新形成的混合物，在很多情況下，SPR可以用同一個(gè)芯片，進(jìn)行同時(shí)測(cè)量。因此，目前SPR是觀察配體和受體之間、抗原和抗體之間相互作用最有前景的一個(gè)方法，并且逐步應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)當(dāng)中。SPR在不斷擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域時(shí)，其檢測(cè)方法的靈敏度也需要不斷得到提高。因?yàn)镾PR方法對(duì)待測(cè)物濃度的測(cè)定主要與物質(zhì)的分子量有關(guān)，對(duì)于分子量大于1000的物質(zhì)，其

5、可測(cè)定濃度范圍約為nM-pM，而對(duì)于分子量小于1000的物質(zhì)，其可測(cè)定濃度范圍為μM-nM。因此不斷探索提高靈敏度的研究方法正成為SPR研究中的一個(gè)重要內(nèi)容。
　　 DNA芯片被大量用于快速、平行檢測(cè)多種DNA或RNA序列。隨著越來越多的斑點(diǎn)技術(shù)的擴(kuò)展，現(xiàn)在使用噴墨打印或光刻生產(chǎn)的DNA芯片，可以在一個(gè)小面積的固體支持物上點(diǎn)上15000種寡核苷酸鏈，因此目前很多研究已將DNA芯片應(yīng)用到mRNA定性定量檢測(cè)和單核苷酸多態(tài)性(sin

6、gle nucleotide polymorphisms，SNPs)的檢測(cè)。隨著DNA芯片技術(shù)的發(fā)展使得單個(gè)DNA芯片探測(cè)整個(gè)基因組成為可能，但對(duì)低濃度的DNA靶序列檢測(cè)存在靈敏度不高的問題依然是當(dāng)前芯片的主要缺點(diǎn)。而液相預(yù)擴(kuò)增方法可克服這一缺點(diǎn)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)，可用來擴(kuò)增芯片分析的目標(biāo)DNA。PCR技術(shù)由于其高靈敏度而被認(rèn)為是DNA檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，PCR技術(shù)因?yàn)?/p>

7、需要昂貴的儀器、精確的溫度控制和對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離，況且不能原位擴(kuò)增，使它在芯片上的運(yùn)用受到極大地限制。因而迫切需要一種高靈敏度、高通量和高速度非PCR的簡(jiǎn)單的檢測(cè)分析方法。
　　 滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification，RCA)在體外使用DNA聚合酶和環(huán)狀DNA模板進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增，其基本原理是:環(huán)狀模板與靶核酸雜交后在連接酶的作用下成環(huán);成環(huán)后的環(huán)狀模板在引物的作用下擴(kuò)增;沿著環(huán)狀模板擴(kuò)增一個(gè)循

8、環(huán)后，聚合酶合成再次到達(dá)了引物聚合酶結(jié)合位點(diǎn)取代新合成的DNA鏈;繼續(xù)合成多個(gè)環(huán)狀模板長(zhǎng)度的擴(kuò)增鏈，由此形成一條由重復(fù)的環(huán)狀模板序列組成的長(zhǎng)鏈DNA分子。并且由于環(huán)狀模板的擴(kuò)增效率比線性模板要高很多，因此單引物RCA已被廣泛用于基因分型和掛鎖探針進(jìn)行突變分析。
　　 RCA是一種對(duì)芯片信號(hào)放大特別有效的方法，在芯片上就能夠識(shí)別、擴(kuò)增、檢測(cè)目標(biāo)分子。與其它擴(kuò)增方法相區(qū)別的是，RCA擴(kuò)增生成的擴(kuò)增產(chǎn)物仍然和固定在芯片上的DNA引物連

9、接。由于這種獨(dú)特的屬性，使RCA能在固相的原位產(chǎn)生微陣列信號(hào)，并且與其它反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行也沒有任何互相干擾。
　　 基于納米金的光學(xué)檢測(cè)可以提供一個(gè)可視化的可見光范圍。由于這種光學(xué)檢測(cè)是依靠基礎(chǔ)的光學(xué)現(xiàn)象，所以檢測(cè)過程比熒光技術(shù)要簡(jiǎn)單得多，樣品的穩(wěn)定性也被加強(qiáng)了。相比于熒光染料具有敏感性和漂白問題，納米金技術(shù)即使是在高光強(qiáng)度下也可進(jìn)行檢測(cè)，并且還能降低理化環(huán)境對(duì)信號(hào)的影響。
　　 納米金技術(shù)可以擴(kuò)增SPR的檢測(cè)信號(hào)，相比非納

10、米金輔助的雜交反應(yīng)大大提高了靈敏度。表面質(zhì)量高和介電常數(shù)高的納米金粒子和金膜之間的電磁耦合大大提高了反射轉(zhuǎn)變。納米金粒子標(biāo)簽具有高信號(hào)/噪聲比使得點(diǎn)大小接近亞微米級(jí)，而熒光芯片僅有微米級(jí)。納米金法可以利用光學(xué)方法讀出結(jié)果而不需要熒光設(shè)備，并且納米金修飾的寡核苷酸探針可以再生方法再利用，以節(jié)約成本。
　　 本文將生物傳感技術(shù)、原位擴(kuò)增技術(shù)以及納米技術(shù)相結(jié)合，運(yùn)用SPR儀檢測(cè)納米金輔助的RCA反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)快速、非標(biāo)記、靈敏、實(shí)時(shí)檢測(cè)丙

11、型肝炎病毒。
　　 研究方法:
　　 1.丙型肝炎病毒RCA檢測(cè)方法的建立
　　 1.1.RCA引物設(shè)計(jì)
　　 從GeneBank中獲得丙型肝炎病毒X-tail基因序列，根據(jù)RCA引物設(shè)計(jì)的原則，設(shè)計(jì)RCA檢測(cè)HCV所需要的環(huán)狀模板、延伸引物以及擴(kuò)增引物。
　　 1.2.丙型肝炎病毒核酸RCA檢測(cè)方法反應(yīng)條件摸索以及反應(yīng)體系的建立
　　 根據(jù)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，將連接酶分為T4 DNA連接酶

12、、pfuDNA連接酶和BSTDNA連接酶三組。將多聚酶分為BSTDNA多聚酶和phi29DNA連接酶兩組，共六組進(jìn)行試驗(yàn)。依據(jù)Tm值，RCA反應(yīng)原理以及酶的活性溫度，來測(cè)試反應(yīng)溫度。
　　 1.3.丙型肝炎病毒核酸RCA檢測(cè)方法特異性測(cè)試
　　 選取流感病毒核酸作為陰性對(duì)照，選取實(shí)驗(yàn)室制備的丙型肝炎病毒核酸純化標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照，雙蒸水作為空白對(duì)照，以RCA方法評(píng)價(jià)丙型肝炎病毒的特異性。
　　 1.4.丙型肝炎病

13、毒RCA檢測(cè)方法最低檢測(cè)濃度測(cè)試
　　 將經(jīng)過定量的HCV cDNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10倍梯度稀釋，運(yùn)用RCA方法確定其檢測(cè)限值。
　　 2.Real-time RT-PCR法檢測(cè)丙型肝炎病毒
　　 選取HCV最保守區(qū)域X-tail基因區(qū)域?yàn)槟康男蛄校O(shè)計(jì)Real-time PCR引物。運(yùn)用Real-time PCR法檢測(cè)HCV，通過檢測(cè)梯度濃度確定其檢測(cè)限，與RCA的檢測(cè)限進(jìn)行比較。
　　 3.滾環(huán)擴(kuò)增

14、芯片檢測(cè)HCV cDNA
　　 將RCA的探針進(jìn)行氨基修飾，與醛基芯片共價(jià)結(jié)合后，通入檢測(cè)體系進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，最后進(jìn)行顯色反應(yīng)，以檢測(cè)HCV DNA。
　　 4.傳統(tǒng)芯片檢測(cè)HCV cDNA
　　 將經(jīng)過定量的HCV cDNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10倍梯度稀釋，用傳統(tǒng)芯片檢測(cè)，并將其檢測(cè)限值與RCA芯片法進(jìn)行比較。
　　 5.SPR技術(shù)結(jié)合RCA法檢測(cè)HCV
　　 根據(jù)丙型肝炎X-tail區(qū)域的特異

15、序列，設(shè)計(jì)并合成RCA法的探針和引物，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。將模板濃度10倍梯度稀釋，評(píng)價(jià)方法的檢測(cè)限。在普通金膜芯片的基礎(chǔ)上，經(jīng)過表面化學(xué)處理，形成高特異性核酸芯片，用抗蛋白實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證芯片抗蛋白能力。使用SPR儀對(duì)金膜芯片上滾環(huán)擴(kuò)增的反應(yīng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)以及信號(hào)放大反應(yīng)等。
　　 6.普通SPR技術(shù)對(duì)HCV的檢測(cè)
　　 (1)普通SPR金膜芯片制備:將裸金膜芯片孵育于12巰基十二烷酸中過夜進(jìn)行自組裝羧基化，再用EDC/NHC(1

16、-乙基-3(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC); N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxysuceini- mide，NHS))進(jìn)行活化后點(diǎn)樣探針。
　　 (2)用1％的BSA對(duì)未結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉。
　　 (3)評(píng)價(jià)SPR檢測(cè)HCV的靈敏度、特異性。
　　 7.運(yùn)用RCA、，real-time PCR、genochip、，RCA genochip、SPR、SPR結(jié)合RCA等技術(shù)對(duì)臨床樣品HCV的檢測(cè)。
　　

17、 采用1～6方法中描述的丙型肝炎病毒RCA、Real-Time RT-PCR、滾環(huán)擴(kuò)增芯片法、傳統(tǒng)芯片方法、SPR技術(shù)結(jié)合RCA法、普通SPR法檢測(cè)臨床血清標(biāo)本中的丙型肝炎病毒。對(duì)上述檢測(cè)方法的靈敏度，特異性以及一些其它指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果:
　　 1.丙型肝炎病毒RCA方法的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)以及評(píng)價(jià)臨床樣品的檢測(cè)
　　 RCA方法對(duì)HCV的最低檢測(cè)濃度為10pM，Real-time RT-PCR檢測(cè)的的最低濃

18、度為0.1nM。
　　 對(duì)63份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中丙型肝炎病人血清標(biāo)本30份，非丙型肝炎血清標(biāo)本33份。在雙盲的情況下，RCA法的靈敏度為80.0％(24/30)，檢測(cè)30份丙型肝炎血清標(biāo)本，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢出16份。RCA檢測(cè)33份HCV陰性血清特異度為87.9％(29/33)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR為90.9％(30/33)。
　　 2.建立滾環(huán)擴(kuò)增芯片檢測(cè)HCV的方法以及對(duì)臨床樣品檢測(cè)的評(píng)價(jià)
　　 RCA芯

19、片法檢測(cè)HCV的最低檢測(cè)濃度為0.1μM。而應(yīng)用傳統(tǒng)雜交方法檢測(cè)HCV cDNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品的最低濃度為10μM。說明在實(shí)驗(yàn)室條件下檢測(cè)HCVeDNA，RCA比傳統(tǒng)雜交法更敏感。
　　 用RCA芯片對(duì)一共179份臨床血清進(jìn)行了檢測(cè)，其中包括丙型肝炎病人血清樣品102份，甲肝及乙肝病人的血清樣品77份。在雙盲的情況下，RCA的敏感性為87.3％(89/102)，特異性為85.7％(66/77)，一致性為86.6％(155/179)，

20、結(jié)果顯示RCA芯片法檢測(cè)HCV的靈敏度和特異度均較好。陽性預(yù)測(cè)值為89％(89/100)，陰性預(yù)測(cè)值為83.5％(66/79)。檢測(cè)102份丙型肝炎血清標(biāo)本，RCA芯片檢測(cè)出89份，普通芯片只檢出27份。檢測(cè)77份陰性樣品，RCA檢測(cè)為陰性的66份，普通芯片為69份。RCA芯片高靈敏度、快速，因此在丙型肝炎病毒的檢測(cè)中比現(xiàn)有的普通芯片有更大的優(yōu)越性和實(shí)用性。
　　 3.SPR技術(shù)結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中HCV
　　

21、 滾環(huán)擴(kuò)增法在1h內(nèi)完成HCV標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，SPR結(jié)合RCA方法對(duì)HCV的陽性標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)濃度為1pmol/L，Real-time PCR的最低檢測(cè)濃度為100pmol/L。在檢測(cè)相同的HCV濃度時(shí)，RCA的SPR信號(hào)明顯高于傳統(tǒng)的雜交信號(hào)，RCA反應(yīng)經(jīng)過納米金信號(hào)放大，整個(gè)反應(yīng)過程更加清晰，反應(yīng)信號(hào)也得到擴(kuò)大。對(duì)于臨床樣品的檢測(cè)，RCA結(jié)合SPR技術(shù)的靈敏度為90％(27/30)，特異性為84.1％(28/33)。
　　

22、結(jié)論:
　　 1.本研究建立的SPR結(jié)合RCA方法，在1h內(nèi)完成HCV的檢測(cè)，比熒光定量PCR有更低的檢測(cè)限。
　　 2.運(yùn)用RCA法檢測(cè)同樣濃度的HCV時(shí)，RCA的SPR信號(hào)明顯高于傳統(tǒng)的雜交的SPR信號(hào)RCA，經(jīng)過納米金的信號(hào)放大，整個(gè)反應(yīng)過程流程更加清晰，反應(yīng)信號(hào)得到進(jìn)一步擴(kuò)大。
　　 3.對(duì)于臨床血清樣品，研究結(jié)果顯示RCA法的靈敏度比real-timePCR要高，特異度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
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