丙型肝炎病毒NS4A與鈣離子信號(hào)調(diào)節(jié)親環(huán)素配體相互作用的研究.pdf

1、目的：探討丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4A(HCV NS4A)與鈣離子信號(hào)調(diào)節(jié)親環(huán)素配體(CAML)的相互作用、作用位點(diǎn)及相互作用后對細(xì)胞基因表達(dá)的影響。 方法：應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選人白細(xì)胞文庫中與HCVNS4A相互作用的蛋白。對克隆重復(fù)率較高的CAML基因進(jìn)行克隆，并構(gòu)建其酵母表達(dá)載體，在酵母細(xì)胞中與HCV NS4A進(jìn)行回交驗(yàn)證之后，構(gòu)建HCV NS4A(pCMV/Myc-NS4A)及CAML(pcDNA3.1/His-A-CAM

2、L)的真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行免疫共沉淀驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建CAML不同剪接體及缺失突變體的酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染入酵母Y187，分別在酵母細(xì)胞中與轉(zhuǎn)染了HCV NS4A酵母表達(dá)載體(pGBKT7-NS4A)的AH109進(jìn)行配合，尋找HCV NS4A與CAML相互作用的具體位點(diǎn)。將HCV NS4A真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CAML的293細(xì)胞，利用基因芯片技術(shù)檢測二者相互作用后對細(xì)胞基因表達(dá)的影響。 結(jié)果：篩選出在鋪有x-α-

3、gal的四缺培養(yǎng)基上能夠生長并變成藍(lán)色的真陽性菌落45個(gè)，其中包括29個(gè)CAML。對CAML基因成功克隆，在酵母細(xì)胞中回交驗(yàn)證了HCV NS4A與CAML的相互作用。構(gòu)建了HCV NS4A及CAML的真核細(xì)胞表達(dá)載體，并利用免疫共沉淀技術(shù)在293細(xì)胞中驗(yàn)證了兩者的相互作用。包含CAML蛋白氨基末端1～57位氨基酸的CAML不同缺失突變體及剪接體的酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入酵母Y187后，均可以與轉(zhuǎn)染pGBKT7-NS4A的AH109成功配合。

4、 基因芯片篩選結(jié)果提示轉(zhuǎn)染HCV NS4A后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CAML基因的293細(xì)胞中共有48種基因的表達(dá)水平上調(diào)，36種基因的表達(dá)水平下調(diào)，其中與Rho蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因6種。 結(jié)論：在293細(xì)胞中HCV NS4A與CAML存在相互作用，其相互結(jié)合的位點(diǎn)位于CAML蛋白親水的氨基末端1～57位氨基酸。二者相互作用可以使細(xì)胞內(nèi)的一系列基因表達(dá)發(fā)生改變，其中包括與細(xì)胞凋亡相關(guān)的Rho蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因。HCV NS4A可能通